2015 Fiscal Year Annual Research Report
核酸の動的構造をプログラムして汎用の増幅型バイオセンサをつくる
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15H03829
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
井原 敏博 熊本大学, 自然科学研究科, 教授 (40253489)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉本 惣一郎 熊本大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (30323067)
今堀 龍志 東京理科大学, 工学部, 講師 (90433515)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | DNAコンジュゲート / DNAサーキット / シグナル増幅 / 電気化学検出 / 希土類錯体 / フェロセン / シクロデキストリン / 化学的ライゲーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究推進に必要なDNAコンジュゲート、およびDNAサーキットを用いたシグナル増幅に必要なすべてのDNAの合成を行った。DNAコンジュゲートに関しては、具体的にはABA-DNA、CyD-DNA、Fc-DNA、EDTA-DNA、Phen-DNAである。DNAコンジュゲートは、ABA-DNA以外はポストモディフィケーションにより合成した。修飾末端にアミノ基を導入したDNAを自動合成装置を用いて合成し、フェロセンカルボン酸、および1,10-フェナンスロリンカルボン酸の活性エステルやEDTA無水物とのカップリングにより、それぞれFc-DNA、Phen-DNAおよびEDTA-DNAを得た。CyD-DNAについては、DNA末端のアミノ基にSPDPを修飾し、チオールを一点修飾したβ-CyDとのカップリングにより得ることができた。ABA-DNAの合成はABA（アミノベンジルアミン）部分をアミダイト試薬として合成しようと試みたが、アミノ基の保護基として使用しているNVOCの安定性がDNAの切り出し条件において十分でないことがわかった。そこで、方針を転換して、ポストモディフィケーションによってABAをDNAに修飾することにした。そのために、ABA-NVOCの活性エステルを合成を進めた。現在、カルボン酸活性化の1段階手前までは順調に合成することができている。
このうち、CyD-DNA/Fc-DNAを用いた増幅型電気化学バイオセンサ、およびEDTA-DNA/Phen-DNAを用いた希土類金属錯体の発光を利用した増幅型発光センサに関しては、鋳型DNA存在下においてのみ、Fc由来の酸化電流の増大、およびTb3+やEu3+錯体からの特徴的な発光を観察することができ、期待した発シグナル機構が有効にはたらくことを確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究代表者はこれまでの研究をとおして、DNAの合成、および修飾の知識と技術を有しているので、ABA-DNAの化学的ライゲーションの系を除いて、研究に必要なすべてのDNA、DNAコンジュゲートを比較的順調に合成することができた。ABA-DNAは当初、光で脱保護可能なNVOCでアミノ基を保護したABAアミダイトを用いて自動合成機において合成する予定であった。ABA-DNA同士の化学的ライゲーションはまだ確認されておらず、生成物の解析には多くの試料が必要と判断して、その他のDNAコンジュゲートと同様のポストモディフィケーションではなく、より高い収量を得ようという意図があったからである。しかしながら、DNA合成後の典型的なDNA切り出し条件においてNVOCが外れ、それに続いて不明の副反応が進行してしまうことが明らかになった。そのため、温和な条件で切り出し可能な特殊なレジンを使用し、さらに、（切り出しと同時に脱保護される）A、G、Cの環外アミノ基の保護基もそのための特殊なものに変更する必要があるが、これらのアミダイトの価格は割高である。条件検討のために保護基のないTのみからなる (dT)n末端にABAアミダイトを付加したDNAを特殊なレジンを用いて合成し、NVOCを温存した切り出し条件の検討を行った。その結果、目的とするDNAを合成することはできたが、その収率とコストを考慮の上、合成方針を転換する決断を下した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ABA-DNAコンジュゲートの合成 ABA（アシルベンジルアミン）は、連続するシッフ塩基形成による環化、およびその後の自動酸化を経てピラジン環を形成し、蛍光性の生成物ABA2を与えると考えられる（DFT計算で予測済み）。本年度はABAの活性エステル体を合成する。
CyD－DNA/Fc-DNA系によるDNAの増幅型電気化学検出 CyD-DNAとFc-DNAの適切な複合体においてFc由来の電気化学シグナルを抑制できることは既に確認している。本年度は、DNAサーキットによるDNA複合体の解離によりFcがCyDから脱離してシグナルが触媒的に回復することを確認する。さらに、増幅率をあげるための条件の最適化を行う。具体的にはエントロピー駆動型のDNAサーキットを用いることを想定している。さらに、DNAサーキットから放出されたFc-DNAを相補的なDNAを修飾した電極に濃縮して数桁の感度向上を試みる。
DNAサーキットによる触媒的希土類錯体生成を利用した核酸検出 EDTA-DNAとPhen-DNAをDNAサーキットに導入することで、希土類錯体を触媒的に生成させ、これをDNAやmiRNAの高感度検出に応用する。具体的には、ヘアピン開放型、HCR（hybridization chain reaction）、およびHCRで用いるヘアピンの極性を反転して閉じた複合体である十字形DNAを形成するタイプのサーキットを利用する予定である。
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