2016 Fiscal Year Annual Research Report
次世代型CRISPRシステムの構築によるヒト遺伝子機能解明のための基盤技術開発
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15H04319
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
程 久美子 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (50213327)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / 遺伝子 / 核酸 / ゲノム / RNA / CRISPR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR-associated proteins (CRISPR/Cas) システムは、原核生物の獲得免疫機構を利用した優れたゲノム編集法である。CRISPR/Cas9システムでは、ガイドとなるRNAが塩基配列の相補性に基づいて認識するゲノム領域をCasエンドヌクレアーゼが切断し、遺伝子の破壊を引き起こす。したがって、本手法は幅広い生物種で任意の遺伝子配列に変異を導入できる可能性を示す一方、意図しない領域に対するoff-target効果も知られている。CRISPR/Casシステムではゲノムを切断して変異を導入するため、一旦変異が導入されたゲノム領域を修復することはむずかしい。そのため、off-target効果は、将来的にヒトなどへ応用することを考慮した場合には重要な問題である。
Off-target効果を軽減する１つの方法として、Cas9に変異を導入することでDNA切断活性を有しないCas9（dCas9）ヌクレアーゼが開発されている。dCas9は標的とする配列に結合することで、遺伝子を破壊することなしにその遺伝子の発現を抑制する作用がある。そのため、dCas9の作用効率は今後のCRISPR/Casシステムの応用において重要な要素の一つである。そこで、当該年度には、Cas9とdCas9の違いを明らかにするため、ヒト培養細胞を用いてレポーター遺伝子を用いた解析を行った。その結果、Cas9が効率的に作用した標的でも、dCas9を用いた場合ではその抑制作用が弱くなることがしばしば見られ、効率的に抑制が起こる配列の特性、効果を示す遺伝子中の標的部位の位置の違いなどがあることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、CRISPRの改良による次世代型の効率的ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目指している。そのため、ガイドRNA配列および塩基長などによってCRISPRによるゲノム編集の効率が異なる分子機構を解明し、効率的なCRISPRゲノム編集法の構築を目指す。さらに、CRISPRによるゲノム編集におけるオフターゲット効果の機構を明らかにすることで、オフターゲット効果を回避する方法を構築すると共に、実用的にオフターゲット効果を回避できる手法の構築を行うことを目指している。現在、dCas9を用いてCas9タンパク質との比較解析を行うことにより、それぞれの特徴が浮き彫りにされてきており、配列や遺伝子上の位置などによる相違が見られている。したがって、より詳細な解析を行うことにより、効率的な特異性の高い手法の構築に近づける状況と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在の結果より、Cas9とdCas9を用いた場合では効率的に抑制が起こる配列の特性、効果を示す遺伝子中の標的部位の位置などに違いがあることが明らかになった。その特性を明確にするため、遺伝子中の標的の位置を前後にずらしたレポータープラスミドを構築した解析を行っている。さらに、標的配列の特性として、特定の領域の熱力学的性質がゲノム編集効率に影響を与えており、特に、dCas9ではその影響が強いと考えられる結果が得られている。そのため、熱力学的性質の相違に基づくレポータープラスミドを構築して、詳細な解析を行う予定である。位置や配列特性が明らかになった場合には、それらの特定を利用した、内在の遺伝子に対するゲノム編集を行う。
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