2015 Fiscal Year Annual Research Report
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15H04589
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| Research Institution | Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine |
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Principal Investigator |
西川 義文 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 准教授 (90431395)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 感染症 / ワクチン / 免疫 / 畜産 / ネオスポラ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は家畜原虫病を引き起こすネオスポラの病原性因子を同定し、それを用いたワクチン開発への応用を目的としている。まず病原性因子のスクリーニング系を構築し、選定した分子について免疫活性化能を検証、原虫側の遺伝子操作や感染実験により病原性因子としての確証を得る。さらに病原性因子を利用したモデルワクチンを作製し、マウスの感染モデルにて感染防御効果を検証することを計画している。平成２７年度は主に下記２項目について研究を実施した。
1.NF-kBプロモーター制御GFP発現プラスミドの作製と形質転換哺乳動物細胞株の樹立：本研究では原虫分子による過剰な炎症反応の誘導が病原性の一因であると想定しているため、免疫反応の誘導に必須なNF-kBシグナルに着目した。NF-kBシグナルの活性化を可視化するために、NF-kB応答配列制御GFP発現プラスミドを作製し、動物細胞へ遺伝子導入して安定的形質転換細胞株を樹立した（NFkB-GFP-cell）。
2.NF-kBシグナルを活性化するネオスポラ分子のスクリーニング：ネオスポラからRNAを回収し、cDNAライブラリーを作製した。現在上記NFkB-GFP-cellへネオスポラcDNAライブラリーを導入し、細胞内GFP蛍光シグナルを検出することでスクリーニングを実施している。それと平行して、当研究室で既に保有しているネオスポラcDNAクローンを用い、NF-kBシグナルを含めた計１４種類の宿主シグナルの変動を解析した。その結果、NF-kBシグナルの活性化に関与する原虫因子１種、免疫細胞の活性化に重要なNFATシグナルの促進に関与する原虫因子２種、神経細胞の機能に重要なCREシグナルの促進に関与する原虫因子１種を選定できた。
今後は、今回同定した原虫因子とcDNAライブラリーからスクリーニングする予定の因子を用い、病原性因子としての可能性を検証していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２７年度に計画した下記２項目についての進捗状況を以下に示す。
1.NF-kBプロモーター制御GFP発現プラスミドの作製と形質転換哺乳動物細胞株の樹立：NF-kBシグナルの活性化を可視化するために、NF-kB応答配列制御GFP発現プラスミドを作製し、動物細胞へ遺伝子導入することで安定的形質転換細胞株を樹立した（NFkB-GFP-cell）。
2.NF-kBシグナルを活性化するネオスポラ分子のスクリーニング：ネオスポラcDNAライブラリーを作製し、NFkB-GFP-cellを用いたスクリーニングを実施している。それと平行して、ネオスポラcDNAクローンを用いたスクリーニングを実施し、NF-kBシグナルの活性化に関与する原虫因子１種、NFATシグナルの促進に関与する原虫因子２種、CREシグナルの促進に関与する原虫因子１種を見出した。
3.その他の実績：ネオスポラ症の克服のためにはその病態を理解する必要があり、またワクチンによる感染予防戦略に加えて治療に有効な薬剤の開発も重要となる。ネオスポラの神経疾患発症メカニズムを理解するために、感染マウスの脳組織を詳細に解析し、神経細胞の機能遺伝子の発現や神経伝達物質の産生に異常が生じていることを見出した。さらに、ネオスポラは植物由来ホルモンであるアブシジン酸を合成していることを明らかとし、その合成阻害剤フルリドンはネオスポラの急性感染を制御できることが示された。したがって、ワクチンと抗原虫薬を併用することで、治療・予防効果の向上が期待できる。上記の科学的知見は論文や学会発表として報告しており、本研究の展開に重要な基礎データを提示したと言える。また、ネオスポラの近縁原虫であるトキソプラズマのワクチン開発について、図書を執筆した。
以上より、当初の計画通りおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度は下記２項目について研究を進める。
1. 候補分子の免疫活性化能の評価：スクリーニングした原虫因子について、in vitro培養系による免疫活性化能の評価を行う。候補分子の組換えタンパク質を大腸菌発現系にて作製し、培養細胞へ添加することで培養上清中の炎症性サイトカインの産生量を測定する。さらに免疫細胞の活性化については、フローサイトメーターを用いてMHC class I及び II、CD80, 86等の分子マーカーの発現を解析する。
2. 候補分子の遺伝子欠損原虫の作出と表現型の解析による病原性因子の特定：免疫活性化能を有する候補分子について、CRISPR/CAS9を用いた遺伝子編集技術により遺伝子欠損ネオスポラを作出する。作出した対象遺伝子欠損原虫について、in vitroとin vivoでの表現型解析を行う。まずヒト線維芽細胞（HFF）を用いたin vitro系にて、感染率、増殖率、宿主細胞からの脱出率を親株原虫と比較する。次に、対象遺伝子欠損原虫及び野生型原虫をマウスに感染させ、マウスの生存、臨床症状を観察し、病原性の違いを解析する。対象遺伝子欠損原虫の病原性の低下が確認されれば、ここで見出された分子をネオスポラの病原性因子と定義する。
病原性因子の作用機序を明らかにするため、原虫因子と相互作用する宿主因子を同定する。具体的には、FLAGタグ融合原虫因子を遺伝子欠損原虫へ導入した原虫株を作製する、この原虫株をHFF細胞へ感染させ、そのライセートをFLAGタグ抗体で免疫沈降し、質量分析（MALDI-TOF-MSあるいはnanoLC-MS/MS）により結合タンパク質を同定する。
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