2016 Fiscal Year Annual Research Report
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15H04606
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
中潟 直己 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (30159058)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 佳子 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 特任助教 (30732739)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マウス / 受精卵 / 核酸導入 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、受精卵でのゲノム編集を容易にし、様々な研究へのアプローチに役立つ技術開発をめざす。今年度は「２、透明帯が存在しても受精卵内に核酸が取り込まれるような方法を開発する。」ことを目的とし、以下3通りの受精卵へのゲノム編集ベクター導入を試みた。
昨年度は裸化卵へCRISPR-Cas9プラスミドベクター（内在遺伝子を標的とするgRNAとCas9を発現するプラスミドDNA）を導入することが困難であったが、今年度、使用条件を細かく検討することにより、プラスミドベクターを高効率に受精卵へ導入でき、ゲノムへの変異導入も可能な条件を見出すことができた。そのため、このプラスミドベクター、および昨年度、裸化卵にて変異導入を確認済のTALEN mRNAの導入を検討し、胚盤胞期胚の解析を行った。
（１）無処理受精卵では、試薬量やリポプレックス複合体作製時のメディウム検討を行い、卵が死滅することなく、正常発生可能な極限まで高濃度のリポフェクション処理を検討したが、胚盤胞期胚の解析において変異導入を確認することはできなかった。
（２）透明帯の菲薄化処理では、透明帯の構造を脆弱化させる試薬として、当研究室でその作用を確認済みの還元型グルタチオンを使用した。また、マウスや家畜の受精卵において広範に使用されている透明帯除去試薬（酸性タイロード、プロナーゼ、コラゲナーゼ）を用いて、受精卵の生存や発生に毒性を与えない程度の段階的な透明帯菲薄化処理を行い、核酸導入を試みた。胚盤胞期胚のゲノミックPCR産物を用いてDNAシーケンス解析を行ったところ、一部の実験区において、弱いピークの標的配列への変異導入を確認することができた。
（３）当研究室に設置済みのレーザー装置を用いて透明帯を穿孔し、透明帯穿孔受精卵へ核酸導入を検討した。胚盤胞期胚のゲノミックPCR産物の塩基配列を解析したところ、標的配列への変異導入を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究計画に沿って研究を遂行し、概ね目的を達成することができた。
昨年度「1、透明帯除去受精卵（裸化卵）を用いて、簡便なリポフェクション法による受精卵へのゲノム編集用ベクターの導入法を開発する。」ことを目的として研究を行い、受精卵の培養液へ直接添加でき、核酸導入効率が高く、卵の生存率や胚発生率の良いリポフェクション試薬を選定した。ゲノム編集用核酸を導入した裸化卵を培養し、胚盤胞期胚を仮親の子宮へ移植したが、裸化卵の使用では、リポフェクション処理や仮親への胚移植作業が困難なうえ、産子への発生率が極めて低率であったことから、本年度は「２．透明帯が存在しても受精卵内に核酸が取り込まれるような方法を開発する。」ことを目的として研究を行った。
昨年度に選定したリポフェクション試薬を使用し、透明帯無処理受精卵や透明帯菲薄化受精卵、透明帯穿孔受精卵へのゲノム編集ベクター導入を検討した。核酸導入後、発生した胚盤胞期胚のゲノミックPCRを行い、ヘテロ二重鎖移動度アッセイ、Cel-Iアッセイおよび制限酵素断片長多型解析にて標的とするゲノム配列への変異導入の有無を確認した。多数の胚盤胞期胚の微量なゲノムDNAを各々増幅し、複数の解析を効率的かつ正確に行うため、多検体の自動分析が可能かつ高感度なマイクロチップ電気泳動装置を購入した。本装置は正確な解析と作業効率化に大変有用であった。
さらに広島大学の山本研究室と連携して研究を進めることにより、確かなゲノム編集技術を用いて本研究課題に取り組むことができた。また、本研究と平行してマイクロインジェクション法を用いたゲノム編集個体の作製を進め、導入する核酸の種類や方法の違いによる産子への発生率や変異導入効率の差異を精査することにより、本研究課題を効率よく進めるための基盤作りを行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度は、27・28年度の結果を基に、「２．透明帯が存在しても受精卵内に核酸が取り込まれるような方法を開発する。」ことを目的とし、更に研究を進める。これまでの胚盤胞胚解析により、良好な結果が得られた条件にて胚移植を行い、産子を解析する。また、これまで本研究と平行して進めてきたマイクロインジェクション法を用いたゲノム編集個体の作製において、ゲノム編集可能な核酸（プラスミドDNAやmRNA）に限らず、合成gRNAおよびCas9タンパク質の複合体（Ribonucleoprotein; RNP）を使用することにより、産子への発生率、変異導入効率共に良好な成績が得られたことから、リポフェクション法によるRNPの導入についても検討する。そのためこれまでの核酸導入用試薬の他、Lipofectamine CRISPRMAX ReagentやXfect Protein Transfection Reagent、TurboFect Transfection Reagent、Pro-DeliverIN Transfection Reagentなどタンパク質導入用リポフェクション試薬の使用を検討する。
ゲノム編集ベクターやgRNAの設計および合成については、連携研究者である広島大学山本教授、佐久間特任講師の協力のもと実施する。また、透明帯菲薄化に使用する新規の試薬開発等について、連携研究者である当研究室の竹尾講師と議論を行いながら研究の推進を図る。
研究の成果は論文、学会発表などにより情報発信を行う。また、リポフェクション法を用いた受精卵への核酸導入によるゲノム編集はこれまでに報告がないため、特許申請の準備も進める。
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| Remarks |
生命資源研究・支援センター 資源開発分野
http://irda.kuma-u.jp/divisions/reproductive_engineer/reproductive_engineer.html
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