2015 Fiscal Year Annual Research Report
実用植物が作る志賀毒素特異的分泌型ＩｇＡ植物抗体の毒素中和作用と安全性の研究
| Project/Area Number |
15H04660
|
|---|
| Research Institution | University of Shizuoka |
|---|
Principal Investigator |
今井 康之 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (80160034)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒羽子 孝太 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (90333525)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 微生物 / 粘膜免疫 / 抗体医薬 / 免疫グロブリンA / 植物発現系 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
今後有用性が期待できる植物に生産させた抗体（植物抗体）の有効性および安全性の研究を目的とした。腸管出血性大腸菌や赤痢菌の志賀毒素(Stx1)に対する組換え型IgA抗体を作り、動物細胞、モデル植物（シロイヌナズナ）、実用植物（レタス）で分泌型IgAとしての発現を行なった。シロイヌナズナ由来のプロモーターを利用した発現カセットを使った発現システムにより、組換え型IgAのH鎖、L鎖、J鎖および分泌片を同時に遺伝子導入して、シロイヌナズナおよびレタスでの分泌型IgAの発現に成功した。Stx1特異的な分泌型IgAの発現をELISAで確認した。また、分泌型IgAタンパク質の組み立ては、SDS/PAGE／western blotで確認した。組換え型シロイヌナズナの葉の抽出物は、ベロ細胞に対するStx1による傷害を中和した。シロイヌナズナにおいて、二重標識金コロイド免疫電子顕微鏡法によってIgAのH鎖および分泌片が葉の内部で共局在することを示した。
シロイヌナズナに生産させた2量体IgAの精製については、チオール親和性クロマトグラフィーおよび調製用液体クロマトグラフィーが有効であった。さらに、小胞体保留シグナルを付加した分泌片をシロイヌナズナに単独発現させたところ、発現量の大幅な改善を認めた。この分泌片タンパク質を精製することに成功した。
ヒト大腸がん細胞の一つであるCaco-2を試験管内で分化させることで、Stx1に対する感受性の上昇を認めた。ヒト大腸上皮細胞を用いたStx1の傷害の中和に基づく植物抗体の評価系が確立できた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
Stx1特異的分泌型IgAのシロイヌナズナでの発現は、順調に進んでいる。また、実用植物であるレタスにおいても、Stx1に結合する分泌型IgAの発現に成功している。なお、小胞体保持シグナルを付加した分泌片の単独発現により、シロイヌナズナでの発現量の大幅な改善を認め、タンパク質としての精製も見通しがついた。この点については、当初の計画を前倒しにして進めることができた。分泌片単独発現植物は、2量体IgA発現シロイヌナズナとの交配相手として有用である。そのうえ、分泌片をマウスに投与することで、植物が生産するタンパク質製剤に対する抗体産生応答（アレルギー誘発）の評価にも利用できる。大腸上皮細胞に対するStx1の傷害活性の測定系としては、ヒト大腸がん細胞を用いて試験管内での抗体による中和を測定する実験系を確立した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
植物に生産させた抗体の生物活性の評価を実現させるため、植物内での抗体産生量の向上および安定性の確保のための研究をすすめる。その目的で、抗体遺伝子に小胞体保留シグナルを付加させるとともに、植物で発現するためのコドン最適化を行なう。これらの修飾を加えた人工遺伝子を合成してベロ毒素特異的な分泌型IgAの生産量の向上を試みる。抗体タンパク質の植物体内での貯蔵の観点から、実用植物としてレタス以外にトマトでの発現にも挑戦する。
植物抗体の安全性の研究については、小胞体保留シグナルを付加してシロイヌナズナで単独に発現させた分泌片タンパク質をマウスに経口投与あるいは静脈内投与し、植物由来の分泌片に対して抗体産生が起こるかどうかを検討することから始める。
ベロ毒素による大腸上皮細胞の傷害活性については、細胞を用いた試験管内での方法に加え、マウス大腸にベロ毒素Stx1を暴露して一過性に大腸上皮細胞の傷害を誘導する実験系を確立する。これらの方法を用いて、植物抗体の有効性を評価する。
|
