2016 Fiscal Year Annual Research Report
好中球ネットーシス上のマイクロ血栓形成メカニズム解明とARDS治療法開発
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15H04686
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
西堀 正洋 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (50135943)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白井 敦 東北大学, 流体科学研究所, 准教授 (20302226)
森 秀治 就実大学, 薬学部, 教授 (50220009)
高橋 英夫 近畿大学, 医学部, 教授 (60335627)
劉 克約 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (40432637)
和氣 秀徳 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (60570520)
勅使川原 匡 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (40403737)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 薬理学 / 蛋白質 / トランスレーショナルリサーチ / 敗血症 / Immunothrombus |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CLP敗血症マウスの肺血管内免疫血栓Immunothrombosisの定量的評価を好中球抗原Gr-1、血小板上抗原CD42d、フィブリンの免疫多重染色で実施した。その結果、敗血症マウスの肺血管床内のGr-1陽性好中球上には、血小板凝集が高率に認められ、同時にフィブリン沈着が存在した。つまり、敗血症ARDSの肺血管床内では、典型的な免疫血栓の形成があることが強く示唆された。精製ヒト血漿HRG静脈内投与による治療は、免疫血栓の絶対数を著明に低下させた。トロンビンによるHRGの試験管内分解反応は、高分子ヘパリンあるいは低分子ヘパリンの存在によって数倍促進された。この機序は、Heparin-induced thrombocytopenia(HIT)の原因の一つである可能性が示唆された。 EAhy926血管内皮細胞を用いたin vitro実験で、LPSやTNF-α刺激によるICAM-1やE-selectin発現、さらに細胞アポトーシスはHRG添加で有意に抑制された。CHO細胞で産生された組換えヒトHRGの活性をヒト好中球の正球化、ROS産生抑制、CLP致死抑制で評価した結果、ほぼ同効力であることを確認した。CLPマウスの血漿HRGの有意な低下が発症後12時間から生じることを経時的な採血で明らかにした。このタイムコースは、LPSの投与によって生じるHRGの低下よりも早い経過であった。肝臓におけるHRGmRNAの低下は両者で大きな差がなかったので、CLPマウスでの急激な血漿HRGの低下には、トロンビンによる分解と、血管内血栓へのHRGの沈着が寄与するものと推測した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CLP敗血症モデルマウスの肺血管床内における血栓の形成が、免疫血栓Immunothrombosisの特徴を有していることを明確に示した。特に肺血管床内の血栓内に存在する好中球の形態的特徴がシトルリン化ヒストンを細胞外に放出したNETosisの形態であることを共焦点レーザー顕微鏡画像の三次元再構築により明確に示すことに成功した。さらに、HRGの低下を起点とし、循環好中球の形態変化、好中球上での血小板凝集と凝固反応の亢進を一連の敗血症病態カスケードとして描き出すことに成功した。これらのカスケードの中に、好中球の強い接着を介した血管内皮細胞の障害と、低HRG下における強い内皮細胞の活性化が存在することを示唆した。CHO細胞で作製した組換え体ヒトHRGがNativeタンパクと同等の生物活性を有していることを好中球正球化活性、活性酸素分子種産生抑制活性（in vitro)、CLP致死性抑制活性(in vivo)の評価系で明らかにすることができた。CLPとLPS注射における血漿HRG低下タイムコースの違いが、肝臓におけるHRG産生抑制の違いではなく、血中での分解速度や、血管内血栓への沈着の差によるものであることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
血栓形成においては、赤血球細胞は受動的な役割、つまり架橋されたフィブリンネットに受動的にトラップされるとこれまで考えられてきている。しかし、赤血球細胞は血中で圧倒的に多い細胞種であり、敗血症時の血管内血栓形成においても、一定の働きをしている可能性がある。この可能性を検証するため、ヒト末梢静脈から採取された血液から、赤血球細胞を単離し、HRGの効果について検討する。これまでの文献報告から、血小板顆粒から放出されるZn2＋が赤血球上のphosphatidyl serine発現を上昇させると言われているので、この発現系をまず用いる。検討項目としては、赤血球の凝集活性に対するHRGの効果や、活性酸素分子種が赤血球凝集に与える効果とそれに対するHRGの作用等を検証する予定である。最近の他グループの研究で、血小板由来のHigh mobility group box-1(HMGB1)が血栓形成の促進因子として働くことが示唆されている。申請者は、HRGがHMGB1と直接結合することをBiacore等を使って観察している。そこで、HRG-HMGB1複合体形成が免疫血栓形成をどのように調節するのかを明らかにすることは、極めて重要な課題となる。試験管内実験系でこの点についての研究を展開する予定である。
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| Remarks |
Okayama University Medical Research Updates：Novel Understanding of Sepsis Physiology and a Proposal of New Treatment Strategy
http://www.okayama-u.ac.jp/eng/research_highlights/index_id38.html
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[Journal Article] Histidine-rich glycoprotein prevents septic lethality through regulation of immunothrombosis and inflammation.2016
Author(s)
Wake H, Mori S, Liu K, Morioka Y, Teshigawara K, Sakaguchi M, Kuroda K, Gao Y, Takahashi H, Ohtsuka A, Yoshino T, Morimatsu H, Nishibori M.
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Journal Title
EBioMedicine
Volume: 9
Pages: 180-194
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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