食物アレルギーにおけるリンパ球と腸内細菌叢のエピジェネティクスの解明による予防法

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04783
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 中村 裕之 金沢大学, 医学系, 教授 (30231476)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 辻口 博聖 金沢大学, 医学系, 特任助教 (00723090) ; 神林 康弘 金沢大学, 医学系, 講師 (20345630) ; 福冨 友馬 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 診断・治療薬開発研究室, 室長 (30463110) ; 八田 耕太郎 順天堂大学, 医学部, 准教授 (90337915)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 食物アレルギー / アレルゲン / エピジェネティクス / 腸内細菌 / Tリンパ球 / テイラーメイド予防法 / DNAメチル化 / 16S rRNA遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

近年、増加傾向を示す食物アレルギーは、アレルゲンである食物の感作成分の多様性の大きさから、早期診断にはまったく新しいバイオマーカーの案出が求められる。アレルゲンと遺伝の相互作用として、Tリンパ球と腸内細菌叢の構成におけるエピジェネティックな変化を調べることによって、そのエピジェネティクス機構を解明し、免疫・腸内細菌・遺伝子バイオマーカーを同定するとともに、食物アレルギーの新しい早期診断法とテイラーメイド予防法を示すために、小児と成人の食物アレルギーの分子疫学を実施した。
1-3歳児（食物アレルギー有病児15人、非有病児20人）および20-40歳の成人（食物アレルギー有病者15人、非有病者20人）の計70人をコホートとした。観察開始時のデータとして、アレルギー（気管支喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、食物アレルギーなど）症状、室内塵やダニ、花粉、昆虫、動物および食物などのアレルゲンに対する感作の状態、採血により総IgE値（RIST）および特異的IgE値（RAST）、サイトカインを調べた。また採血により得られたリンパ球を、表面マーカーによって分離されたCD4+T cells、CD8+T-cells、CD56+NK cells、CD19+Bcell、CD14+monocytes、Regulatory T cell (Treg)、effector T cell (Teff) subsets (CD4+CD25neg Teff , CD4+CD25hiCD127lo/- Treg)のDNAメチル化を調べた。また対象者から採取する糞便より、全細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子クローンライブラリー法を用いて腸内細菌叢の菌種解析を行った。その結果、enterobacteriaceae, enterococcaceae, staphylococcaceaeなどの主要菌種とリンパ球のDNAメチル化の関係には、アレルギー有症者において認められた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

分子疫学として、1-3歳児（食物アレルギー有病児15人、非有病児20人）および20-40歳の成人（食物アレルギー有病者15人、非有病者20人）の計70人をコホートとすることができたことは、次年度以降のコホートの増大を考えれば、本研究の目的である食物アレルギーの新しい早期診断法とテイラーメイド予防法を示すことが可能となる。また観察開始時のデータとして、リンパ球のCD4+T cells、CD8+T-cellsなどのサブタイプの数量化とDNAメチル化を調べることができ、さらには糞便からの全細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子クローンライブラリーを作成できたことも「おおむね順調に進んでいる」とした理由である。

Strategy for Future Research Activity

今後の分子疫学研究では、1-6歳児（食物アレルギー有病児50人、非有病児50人）および20-40歳の成人（食物アレルギー有病者50人、非有病者50人）にまでコホートを増大させる。この計200人に対して採血により得られるリンパ球を、表面マーカーによって分離されたCD4+T cells、CD8+T-cells、CD56+NK cells、CD19+Bcell、CD14+monocytes、Regulatory T cell (Treg)、effector T cell (Teff) subsets (CD4+CD25neg Teff , CD4+CD25hiCD127lo/- Treg)のトランスクリプトーム解析（mRNASeq, Small RNASeq）、エピゲノム解析（ChIPSeq, DNAメチル化）を実施する。
また対象者から採取する糞便より、細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子特異的プライマーを用いてPCRを行う。得られたPCR産物をクローニングし、その塩基配列をMiSeqによって解析し、最終的に作成した糞便より作成したcDNAライブラリーの配列情報をCOGsやKEGG，MG-RASTなどのデータベースにより解析する。また同時にメタゲノム解析を行う。その際、サンプル中に含まれる全細菌DNAを抽出して断片化し，クローニングを行うことによってライブラリーを作製する。それぞれのライブラリーについてMiSeqによって得られた配列データのアセンブリを行い、ゲノムを再構築する。この方法によって、サンプル中に存在する細菌種の同定のみならず，細菌ゲノムおよび遺伝子配列や数量の決定、細菌叢機能の解析を可能とする。

Research Products

• [Journal Article] A Longitudinal Study of Association between Heavy Metals and Itchy Eyes, Coughing in Chronic Cough Patients: Related with Non-Immunoglobulin E Mediated Mechanism. (2016)
  • Author(s): Nguyen TT, Higashi T, Kambayashi Y, Anyenda EO, Michigami Y, Hara J, Fujimura M, Tsujiguchi H, Kitaoka M, Asakura H, Hori D, Hibino Y, Konoshita T, Nakamura H
  • Journal Title: Int J Environ Res Public Health. Volume: 13(1) Pages: 110
  • DOI: 10.3390/ijerph13010110.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Prevalence of Chronic Pain, Especially Headache, and Relationship with Health-Related Quality of Life in Middle-Aged Japanese Residents. (2016)
  • Author(s): Mitoma J, Kitaoka M, Asakura H, Anyenda EO, Hori D, Nguyen TT, Hamagishi T,Hayashi K, Suzuki F, Shimizu Y, Tsujiguchi H, Kambayashi Y, Hibino Y, Konoshita T, Sagara T, Shibata A, Nakamura H
  • Journal Title: Health. Volume: 8 Pages: 116-124
  • DOI: 10.4236/health.2016.81014.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Usefulness of Electrocardiographic Voltage to Determine Myocardial Fibrosis in Hypertrophic Cardiomyopathy. (2016)
  • Author(s): Konno T, Nagata Y, Teramoto R, Fujino N, Nomura A, Tada H, Sakata K, Furusho H, Takamura M, Nakamura H, Kawashiri MA, Yamagishi M, Hayashi K
  • Journal Title: Am J Cardiol. Volume: 117(3) Pages: 443-449
  • DOI: 10.1016/j.amjcard.2015.11.015.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Pharmacokinetics, Safety and Tolerability of Melissa officinalis Extract which Contained Rosmarinic Acid in Healthy Individuals: A Randomized Controlled Trial. (2015)
  • Author(s): Noguchi-Shinohara M, Ono K, Hamaguchi T, Iwasa K, Nagai T, Kobayashi S, Nakamura H, Yamada M
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 10(5) Pages: e0126422
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0126422.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Right ventricular hypertrophy is associated with cardiovascular events in hypertrophic cardiomyopathy: evidence from study with magnetic resonance imaging. (2015)
  • Author(s): Nagata Y, Konno T, Fujino N, Hodatsu A, Nomura A, Hayashi K, Nakamura H, Kawashiri MA, Yamagishi M
  • Journal Title: Can J Cardiol. Volume: 31(6) Pages: 702-708
  • DOI: 10.1016/j.cjca.2014.12.036.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Semi-comprehensive analysis of gene amplification in gastric cancers using multiplex ligation-dependent probe amplification and fluorescence in situ hybridization. (2015)
  • Author(s): Ooi A, Oyama T, Nakamura R, Tajiri R, Ikeda H, Fushida S, Nakamura H, Dobashi Y
  • Journal Title: Mod Pathol. Volume: 28(6) Pages: 861-871
  • DOI: 10.1038/modpathol.2015.33.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Genetic Variant in the Distal Enhancer Region of the Human Renin Gene Affects Renin Expression. (2015)
  • Author(s): Makino Y, Konoshita T, Omori A, Maegawa N, Nakaya T, Ichikawa M, Yamamoto K, Wakahara S, Ishizuka T, Onoe T, Nakamura H; Genomic Disease Outcome Consortium (G-DOC) Study Investigators
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 10(9) Pages: e0137469
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0137469.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Electrocardiographic QRS Fragmentation as a Marker for Myocardial Fibrosis in Hypertrophic Cardiomyopathy. (2015)
  • Author(s): Konno T, Hayashi K, Fujino N, Oka R, Nomura A, Nagata Y, Hodatsu A, Sakata K, Furusho H, Takamura M, Nakamura H, Kawashiri MA, Yamagishi M
  • Journal Title: J Cardiovasc Electrophysiol. Volume: 26(10) Pages: 1081-1087
  • DOI: 10.1016/j.amjcard.2015.11.015.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 黄砂を含む環境中化学物質の呼吸器疾患への影響に対するゼロ次予防 (2015)
  • Author(s): 中村裕之、神林康弘、東朋美
  • Organizer: 第13回日本予防医学会学術総会
  • Place of Presentation: フレンドパーク石川（石川県）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-21
• [Presentation] 生活習慣および精神的健康度と健診受診行動との関連 (2015)
  • Author(s): 辻口博聖、堀大介、神林康弘、朝倉大貴、北岡政美、三苫純子、Anyenda Enoch Olando、Nguyen Thi Thu Thao、濱岸利夫、中村剛、木戸康人、能登裕幸、鈴木史彦、荒舩丈一、清水由香里、林宏一郎、日比野由利、柴田亜樹、相良多喜子、中村裕之
  • Organizer: 第13回日本予防医学会学術総会
  • Place of Presentation: フレンドパーク石川（石川県）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-21
• [Presentation] 大気粒子状物質中PAH やPM2.5 やSO2と成人慢性咳嗽患者における咳症状との関連 (2015)
  • Author(s): Anyenda Enoch Olando、神林康弘、東朋美、Nguyen Thi Thu Thao、道上義正、原丈介、藤村政樹、辻口博聖、北岡政美、朝倉大貴、堀大介、三苫純子、中村剛、木戸康人、能登裕幸、日比野由利、中村裕之
  • Organizer: 第13回日本予防医学会学術総会
  • Place of Presentation: フレンドパーク石川（石川県）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-21
• [Presentation] 慢性咳嗽患者における重金属と目のかゆみと咳との関連 IgE レベルによる違い (2015)
  • Author(s): Nguyen Thi Thu Thao、神林康弘、東朋美、Anyenda Enoch Olando、道上義正、原丈介、藤村政樹、辻口博聖、北岡政美、朝倉大貴、堀大介、三苫純子、中村剛、木戸康人、能登裕幸、日比野由利、中村裕之
  • Organizer: 第13回日本予防医学会学術総会
  • Place of Presentation: フレンドパーク石川（石川県）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-21
• [Presentation] 精神的健康度と性，年代，生活習慣要因の関連－金沢市一般住民の横断調査 (2015)
  • Author(s): 堀大介、辻口博聖、神林康弘、濱岸利夫、北岡政美、三苫純子、朝倉大貴、鈴木史彦、Anyenda Enoch Olando、Nguyen Thi Thu Thao、中村 剛、木戸康人、能登裕幸、荒舩丈一、清水由香里、林宏一郎、日比野由利、柴田亜樹、相良多喜子、笹原信一朗、松崎一葉、中村裕之
  • Organizer: 第13回日本予防医学会学術総会
  • Place of Presentation: フレンドパーク石川（石川県）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-21
• [Presentation] 地域における歯科医療受診者への栄養・食生活支援に関する研究 (2015)
  • Author(s): 三浦千佳、木戸康人、大滝直人、西村優希、林宏一、柴田亜樹、逸見眞理子、大西孝司、中村裕之
  • Organizer: 第13回日本予防医学会学術総会
  • Place of Presentation: フレンドパーク石川（石川県）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-21
• [Presentation] 管理栄養士養成における歯科口腔保健分野教育の課題 - 管理栄養士養成課程学生調査結果からみた一考察 - (2015)
  • Author(s): 柴田亜樹、三浦千佳、木戸康人、大滝直人、西村優希、林宏一、逸見眞理子、大西孝司、中村裕之
  • Organizer: 第13回日本予防医学会学術総会
  • Place of Presentation: フレンドパーク石川（石川県）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-21
• [Presentation] 成人喘息のクラスター解析の現状と展望－厚生労働科学研究（大田班）の知見を含めて－ (2015)
  • Author(s): 長瀬洋之、釣木澤尚実、岩永賢司、田中明彦、谷田貝洋平、斎藤純平、鈴川真穂、東元一晃、井上博雅、棟方充、檜澤伸之、東田有智、秋山一男、出原賢治、中村裕之、大田健
  • Organizer: 第64回日本アレルギー学会学術大会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪 国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2015-05-26 – 2015-05-28