2016 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム修復とiPS細胞技術を併用した先天性食細胞異常症に対する遺伝子治療法の開発
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15H04874
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
小池 健一 信州大学, 医学部, 特任教授 (40143979)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中沢 洋三 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (60397312)
重村 倫成 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (70623916)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / ゲノム修飾 / 先天性好中球減少症 / 遺伝子治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）ELANE変異を有する重症先天性好中球減少症（SCN）患者の末梢血T細胞にOct3/4, Sox2, Klf4, c-MycのcDNAをセンダイウイルスによりtransfectし、iPS細胞を作製した。
２）A549細胞株を用いてZFNによる遺伝子改変の検討を行った。ピューロマイシン添加培養液で培養開始後、約2週間でA549細胞のコロニーが形成された。各コロニー細胞から抽出したゲノムDNAを用いたPCR法を行った結果、A549細胞の適切な遺伝子座位でドナープラスミド配列への置換が確認された。
３）昨年度樹立したPTPN11変異を有する若年性骨髄単球性白血病（JMML）患者由来のiPS細胞を用いてgene editingを検討した。MEF上で維持・培養したiPS細胞をReproFF2培地へ移しMEF非存在下で培養した。約1週間後に、iPSコロニーを回収し、TrypLE Selectを用いて処理を行った後に、ヌクレオフェクション法でドナーベクターとZFN発現ベクターを同時に核内導入し、1日培養後にピューロマイシンを添加し培養した。2週間後に形成された各コロニー細胞から抽出したゲノムDNAを用いてPCR法を行った結果、該当遺伝子の適切な座位でドナープラスミド配列への置換が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）ELANE変異を有するSCN患者の末梢血T細胞からiPS細胞を作製した。
２）A549細胞株を用いてZFNによる遺伝子改変を検討した結果、適切な遺伝子座位でドナープラスミド配列への置換が確認できた。
３）iPS細胞から造血幹細胞への分化においてもgene editingが可能かを検討するため、細胞増殖能が高いJMML患者由来のPTPN11変異を有するiPS細胞を用いた。樹立したJMML-iPS細胞をMEF上からReproFF2培地へ移しMEF非存在下で培養したところ、該当遺伝子の適切な座位でドナープラスミド配列への置換が確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度は以下の研究を遂行する。
１）SCN患者の末梢血T細胞から樹立したiPS細胞を用いて、ELANE遺伝子変異を修復・非修復のiPS細胞からの造血幹細胞-好中球分化の差異を検討する。CD34陽性細胞におけるCD45, CD38, CD33, c-kitなどの表面マーカーをフローサイトメトリーで解析し、メチルセルロースによるコロニー形成能を調べる。また、好中球系への増殖分化能も比較検討する。
２）約20%のSCN患者で見られる骨髄異形成症候群（MDS）・急性骨髄性白血病（AML）は本症患者にとっては重大な合併症である。このため、G-CSF receptor (G-CSFR)変異 +/- RUNX1変異をSCN-iPS細胞に導入し、CD34陽性細胞の増殖分化能を正常iPS細胞と比較し、MDS・AMLの発症メカニズムを解析する。SCN-iPS細胞、G-CSFR変異(+)SCN-iPS細胞、RUNX1変異(+)SCN-iPS細胞、G-CSFR変異(+)RUNX1変異(+)SCN-iPS細胞から導入されるCD34陽性細胞数を比較する。次いで、これらのCD34陽性細胞の低濃度～至適濃度のG-CSFに対する増殖応答や産生される好中球の数的・質的差異を比較する。
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[Journal Article] Pazopanib Therapy in Combination With Ifosfamide, Carboplatin, and Etoposide in an Early Infant With Progressive Soft Tissue Sarcoma.2017
Author(s)
Watanabe T, Kurata T, Sano K, Suzuki S, Kaneko T, Motobayashi M, Shigemura T, Sumi T, Koike K, Nakazawa Y.
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Journal Title
J Pediatr Hematol Oncol
Volume: 39
Pages: 154-156
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Viral load and ganciclovir (GCV) concentration in cerebrospinal fluid of patients successfully treated with GCV or valGCV for human herpesvirus 6 encephalitis/myelitis following umbilical cord blood transplantation.2016
Author(s)
D. Morita, K. Hirabayashi, Y. Katsuyama, H. Morokawa, M. Motobayashi, T. Kurata, T. Shigemura, M. Tanaka, Y. Inaba, K. Koike, Y. Nakazawa.
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Journal Title
Transpl Infect Dis
Volume: 18
Pages: 773-776
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Loss of Mismatched HLA on the Leukemic Blasts of Patients With Relapsed Lymphoid Malignancies Following Bone Marrow Transplantation From Related Donors With HLA Class II Mismatches in the Graft Versus Host Direction.2016
Author(s)
Hirabayashi K, Kurata T, Horiuchi K, Saito S, Shigemura T, Tanaka M, Yanagisawa R, Matsuda K, Sakashita K, Koike K, Nakazawa Y
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Journal Title
Pediatr Blood Cancer
Volume: 63
Pages: 709-11
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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