軟骨形成性腫瘍特異的な変異IDHの機能の解明とそれに基づく治療法の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04956
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 戸口田 淳也 京都大学, 再生医科学研究所, 教授 (40273502)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池谷 真 京都大学, iPS細胞研究所, 准教授 (20442923) ; 金 永輝 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 特定助教 (90620344) ; 岡本 健 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (30414113)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 軟骨形成腫瘍 / IDH / 間葉系幹細胞 / 神経幹細胞 / ヒストンメチル化

Outline of Annual Research Achievements

IDH (isocitrate dehydrogenase) 遺伝子群の変異は、その頻度より軟骨形成腫瘍である内軟骨腫及び中心型軟骨肉腫におけるドライバー遺伝子であると考えられるが、その腫瘍発生における意義に関しては明らかにされていない．本研究では薬剤誘導型ベクターを用いて変異IDHをiPS細胞に導入し、間葉系幹細胞を誘導、更に骨及び軟骨細胞を誘導し、細胞種特異的な変異IDHの機能を解析することで、軟骨形成腫瘍におけるIDH変異の役割を解明する．軟骨形成腫瘍と同等に変異IDHがドライバー変異である神経膠腫との比較のために、神経幹細胞へも誘導する．そして付加的な変異遺伝子を導入することで、in vitroの形質転換による軟骨形成腫瘍の作製を目指し、その成果に基づいてIDHを標的とした新規治療法の開発を試行する．平成27年度は下記の成果を得た．
1. R132C型及びR132H型IDHを薬剤誘導型ベクターに組み込み、IDH変異体を薬剤により発現誘導できるiPS細胞を作製し、これまでに開発した神経堤細胞を経由する誘導法を用いて、間葉系幹細胞を分化誘導した．
2. 誘導した間葉系幹細胞及びそこから更に誘導した軟骨細胞及び骨細胞において、変異IDHを発現させ、軟骨及び骨関連遺伝子の発現を解析し、更に分化能に対する影響を評価した．
3. 変異IDHによって産生される2-HGの標的の1つであるヒストンメチル化に関して、軟骨及び骨関連遺伝子の発現調節領域のヒストンメチル化を解析した．
4. iPS細胞より神経幹細胞を分化誘導し、変異IDH遺伝子を発現させ、軟骨及び骨関連遺伝子の発現及びヒストンメチル化の変化を解析し、間葉系関幹細胞での変化と比較検討した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初、導入した変異IDH遺伝子の発現レベルを一定とするために、セーフハーバーとして知られているAAVS遺伝子座にシングルコピーで挿入した細胞を作製したが、培養過程においてやはりDNAメチル化によるサイレンシングが生じている可能性が明らかになった．そのため、他の遺伝子座への挿入を検討している．その他の点においては、計画は順調に進行出来ている．

Strategy for Future Research Activity

今後は以下の研究を展開する方針である．
１ IDH遺伝子の各変異型特異的な作用の解析：前年度の研究を継続し、薬剤誘導型ベクターを用いて各変異型IDH1/2遺伝子を導入したiPS細胞を作成し、それらの骨及び軟骨分化誘導実験を行い、各変異体の分化能に対する作用を解析する．更に代表的な骨及び軟骨関連遺伝子に関して、遺伝子発現及びヒストンメチル化を解析し、変異型とそのMSCの分化能に対する影響の間の相関に関して解析する．
２．細胞系譜特異的な変異IDHの作用の解析：同一変異体をMSC、骨細胞及び軟骨細胞で発現させた際の作用を、網羅的な遺伝子発現プロファイル及び代表的なヒストンメチル化モチーフ(H3K4me3、H3K9me3及びH3K27me3)に関する網羅的ChIPにより、比較検討する。更にiPS細胞から神経幹細胞を誘導し、骨及び軟骨関連遺伝子に関して遺伝子発現及びヒストンメチル化解析を行い、MSCの結果と比較することで、細胞系譜特異的な作用を解析する．
３．変異IDHの作用における2-HGの意義の解析：変異IDHの2-HG産生以外の機能の意義を解析するために、同一細胞で変異IDHを発現させた場合と、2-HGを培地に添加した場合での細胞に対する作用を、分化能、遺伝子発現及びヒストンメチル化等の指標で評価する．
４．変異IDH導入MSCを用いた形質転換実験：変異IDH遺伝子を導入したMSC(IDH-MSC)に、高悪性度軟骨肉腫において高頻度に検出されるp53遺伝子の変異を導入する（変異型p53遺伝子の導入あるいはゲノム編集技術を用いたノックアウト）(p53/IDH-MSC)．作製した細胞の増殖能、足場依存性及び浸潤移動能を解析し、in vitroでの形質転換を評価する．更にIDH-MSC及びp53/IDH-MSCをそれぞれマトリゲルに包埋した後、免疫不全マウスの大腿骨骨髄内に移植し、腫瘍形成の有無を評価する．

Research Products

• [Journal Article] SS18-SSX, the Oncogenic Fusion Protein in Synovial Sarcoma, Is a Cellular Context-Dependent Epigenetic Modifier. (2015)
  • Author(s): Tamaki S, Fukuta M, Sekiguchi K, Jin Y, Nagata S, Hayakawa K, Hineno S, Okamoto T, Watanabe M, Woltjen K, Ikeya M, Kato T Jr, Toguchida J.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0142991
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0142991
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mutant IDH1 Dysregulates the Differentiation of Mesenchymal Stem Cells in Association with Gene-Specific Histone Modifications to Cartilage- and Bone-Related Genes. (2015)
  • Author(s): Jin Y, Elalaf H, Watanabe M, Tamaki S, Hineno S, Matsunaga K, Woltjen K, Kobayashi Y, Nagata S, Ikeya M, Kato T Jr, Okamoto T, Matsuda S, Toguchida J.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0131998
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0131998
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Primary central chondrosarcoma of long bone, limb girdle and trunk: Analysis of 174 cases by numerical scoring on histology (2015)
  • Author(s): 5.Konishi E, Nakashima Y, Mano M, Tomita Y, Nagasaki I, Kubo T, Araki N, Haga H, Toguchida J, Ueda T, Sakuma T, Imahori M, Morii E, Yoshikawa H, Tsukamoto Y, Futani H, Wakasa K, Hoshi M, Hamada S, Takeshita H, Inoue T, Aono M, Kawabata K, Murata H, Katsura K, Urata Y, Ueda H, Yanagisawa A.
  • Journal Title: Pathol Int Volume: 65 Pages: 468-475
  • DOI: 10.1111/pin.12324
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Screening of BCOR-CCNB3 sarcoma using immunohistochemistry for CCNB3: A clinicopathological report of three pediatric cases. (2015)
  • Author(s): Shibayama T, Okamoto T, Nakashima Y, Kato T, Sakurai T, Minamiguchi S, Kataoka TR, Shibuya S, Yoshizawa A, Toguchida J, Haga H.
  • Journal Title: Pathol Int Volume: 65 Pages: 410-414
  • DOI: doi: 10.1111/pin.12319
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Mutant IDH1 desregulates the differentiation property of human mesenchymal stem cells through gene-specific epigenetic modification (2015)
  • Author(s): Toguchida J, Jin Y, Watanabe M, Okamoto T
  • Organizer: 第20回CTOS
  • Place of Presentation: Salt Lake City（USA）
  • Year and Date: 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] SS18-SSX, the oncogenic fusion protein in synvival sarcoma, is a cellular context-dependent epigenetic modifier (2015)
  • Author(s): Tamaki S, Fukuta M, Sekiguchi K, Hayakawa K, Jin Y, Hineno S, Okamoto T, Watanbe M, Woltjen K, Ikeya M, Kato T, Toguchida J
  • Organizer: 第20回CTOS
  • Place of Presentation: Salt Lake City（USA）
  • Year and Date: 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 間葉系幹細胞の骨軟骨分化能における変異型IDH1の影響 (2015)
  • Author(s): 岡本健、金永輝、玉置さくら、松田秀一、戸口田淳也
  • Organizer: 第53回日本癌治療学会学術集会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2015-10-31
• [Presentation] 細胞初期化技術を用いた肉腫発生メカニズム解析 (2015)
  • Author(s): 河村真吾、秋山治彦、大野貴敏、山田一成、戸口田淳也、山田泰広
  • Organizer: 第30回日本整形外科学会基礎学術集会
  • Place of Presentation: 富山国際会議場（富山県富山市）
  • Year and Date: 2015-10-23
• [Presentation] 変異型IDH1は骨・軟骨関連遺伝子のヒストンを遺伝子特異的に修飾し、間葉系幹細胞の分化能を脱制御する (2015)
  • Author(s): 金永輝、Hassan Elalaf、渡辺真、玉置さくら、日根野翔、松永一仁、Knut Woltjen、岡本健、松田秀一、戸口田淳也
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-10
• [Presentation] 軟骨肉腫の全ゲノム解析 (2015)
  • Author(s): 十時泰、吉田朗彦、細田文恵、中村浩美、濱奈津子、小倉浩一、新井康仁、戸口田淳也、川井章、柴田龍弘
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] iPS細胞技術の肉腫研究への応用 (2015)
  • Author(s): 戸口田淳也
  • Organizer: 第48回日本整形外科学会骨軟部腫瘍学術集会
  • Place of Presentation: かがわ国際会議場（香川県高松市）
  • Year and Date: 2015-07-10
  • Invited
• [Presentation] 間葉系幹細胞の骨分化能における変異型IDH1の影響 (2015)
  • Author(s): 金永輝、Hassan Elalaf、渡辺真、玉置さくら、日根野翔、松永一仁、Knut Woltjen、岡本健、松田秀一、戸口田淳也
  • Organizer: 第48回日本整形外科学会骨軟部腫瘍学術集会
  • Place of Presentation: かがわ国際会議場（香川県高松市）
  • Year and Date: 2015-07-09
• [Presentation] BCOR-CCNB3融合遺伝子陽性のEwing-like sarcomaの治療経験 (2015)
  • Author(s): 朴憲之、岡本健、仲俣岳晴、中山富貴、松田秀一、戸口田淳也
  • Organizer: 第48回日本整形外科学会骨軟部腫瘍学術集会
  • Place of Presentation: かがわ国際会議場（香川県高松市）
  • Year and Date: 2015-07-09