2016 Fiscal Year Annual Research Report
口腔がん克服に向けた代謝ストレスシグナル制御機構の解明
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15H05019
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
西頭 英起 宮崎大学, 医学部, 教授 (00332627)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ストレス応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔領域で頻発する固形がんは、十分な血管新生がともなわないため低酸素・低グルコースストレス状態にあり、がん細胞は代謝要求性がきわめて高い状態にある。このようなストレス下では、オートファジーが細胞増殖に貢献していると考えられる。さらに、低栄養は不良タンパク質蓄積をまねき、小胞体ストレス誘導性の生存・増殖シグナルが発信される。このようなストレス耐性状態にある口腔がんを克服する一つの方策として、オートファジーや小胞体から発信される生存シグナルを抑制し、強い小胞体ストレスによる細胞死シグナルを惹起することが有効であると考えられる。本研究では、がん細胞における代謝ストレスシグナルを解明し、その分子標的に基づき、増殖シグナルを細胞死シグナルへと変換させることで新規口腔がん治療法開発に繋げることを目的と、下記の検証を実施した。
単鎖型中和抗体および結合阻害ペプチドの効果の有無を、リコンビナントAtg12とIRE1α（細胞質内領域）を用いて、分子間相互作用測定装置により解析した。その結果をもとに、抗体およびペプチドを改変することでさらに活性の高い阻害剤の開発を進めている。結合阻害活性においてin vitro実験系で最適化された単鎖型中和抗体および結合阻害ペプチドについて、CMVプロモーター下に挿入した環状DNAプラスミドベクターを作製した。HEK293細胞などを用いて、結合阻害活性を生化学的に確認した後に、扁平上皮がん細胞へ発現させ細胞内在性Atg12/Atg5-IRE1α結合レベルおよびXBP1、NF-κB、JNK経路の活性化を検証した。併せて、IRE1αの活性レベルについても解析し、これらの分子の関与を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
Atg12/Atg5-IRE1α結合阻害ベクターの開発について下記のin vitro、in cell、in vivo実験系により、単鎖型中和抗体および結合阻害ペプチドについて検証を行い、十分な成果を得ることが出来た。
[in vitro評価] 単鎖型中和抗体および結合阻害ペプチドの効果の有無を、リコンビナントAtg12とIRE1α（細胞質内領域）を用いて、分子間相互作用測定装置により解析し、その有効性を得た。
[in cell評価] 結合阻害活性においてin vitro実験系で最適化された単鎖型中和抗体および結合阻害ペプチドについて、CMVプロモーター下に挿入した環状DNAプラスミドベクターを作製する。HEK293細胞などを用いて、結合阻害活性を生化学的に確認した後に、扁平上皮がん細胞へ発現させ細胞内在性Atg12/Atg5-IRE1α結合レベルおよびXBP1、NF-κB、JNK経路の活性化を検証し、それらの関与を示すことが出来た。併せて、IRE1αの活性レベルについても解析した。in cellでの最終評価として、扁平上皮がん細胞を低酸素・低栄養環境で培養することで、オートファジーと小胞体ストレスを惹起させ、その状況での細胞生存・増殖と細胞死誘導の細胞応答バランスについて、生化学的・細胞生物学的に証明した。
[in vivo評価] マウス個体レベルでの評価を目指すため、ウィルスによる結合阻害分子（単鎖型中和抗体および結合阻害ペプチド）の導入を目指した。ベクターとしては、増殖細胞に効率的に導入が可能なレトロウィルスと、現在既に遺伝子治療の実績が多いアデノ随伴ウィルス（AAV）の両者を検討し、その有効性を示すことが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、これまでの知見を元に、阻害物質の探索を目指し、スクリーニング法の開発と探索を行う。
スクリーニング系の開発：単鎖型抗体や結合阻害ペプチドは、口腔がんの新たな治療コンセプトとしての可能性が期待される。そこで、in cellレベルで結合をハイスループットに評価するスクリーニング系の構築を試みる。具体的な方策としては、細胞にHAやFlagなどのタグ標識をしたAtg12/Atg5 とIRE1αを外来性に導入した安定発現株を作製する。その後、この細胞を96wellあるいは384wellプレートにて一定時間培養し、培地を除去後固定操作、細胞膜溶解の後、各タグに対する蛍光標識抗体を用いてTime resolution with fluorescence resonance energy transferにより、高感度に結合強度の変化を測定する。
・結合阻害化合物スクリーニングの実施：上記スクリーニング系の確立に基づいて共通リソースとして利用可能な化合物をスクリーニングする。ヒット化合物をシード化合物として、細胞透過性・細胞毒性などを考慮し最適化に繋げる。
・siRNAスクリーニングの実施と解析：Atg12/Atg5-IRE1αの結合と解離、さらにはその生理的意義については、まだまだ不明な点が多く残されている。そこで、両結合に関与する分子群を遺伝学的に探索するため、スクリーニング系にゲノムワイドsiRNAライブラリーを応用し、口腔がんの低酸素・低栄養環境下でのオートファジー-小胞体間のストレスシグナルクロストークに関わる分子群を同定することを試みる。これにより、ストレス状況下でのAtg12/Atg5-IRE1α結合・解離の生理的意義を明らかにすることを目指す。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] The ASK1-specific inhibitors K811 and K812 prolong survival in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.2016
Author(s)
Fujisawa T, Takahashi M, Tsukamoto Y, Yamaguchi N, Nakoji M, Endo M, Kodaira H, Hayashi Y, Nishitoh H, Naguro I, Homma K, Ichijo H
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Journal Title
Hum. Mol. Genet.
Volume: 25
Pages: 245-253
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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