2015 Fiscal Year Annual Research Report
小分子RNAとクロマチン因子によるゲノムレベルの非自己認識機構
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15H05583
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
岩崎 由香 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (80612647)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 小分子RNA / トランスポゾン / クロマチン因子 / RNAサイレンシング / エピゲノム制御 / リンカーヒストン / Piwi-piRNA複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
トランスポゾンをゲノムにおける「非自己」として選択的に抑制する仕組みが生物には必須である。piRNAと呼ばれる非コード小分子RNAが核内でトランスポゾン領域のヘテロクロマチン化に関与し、発現抑制を担っていることが示唆されているが、その責任因子および分子機構は未解明である。これを明らかにするために、Piwi-piRNA複合体の構成因子を同定し、これがゲノム中のどの領域でどのように働くかを解明する。まず、Piwi-piRNA複合体構成因子の同定に向けて、Piwiと核内で相互作用するタンパク質を解析した。その結果、新たなPiwi相互作用因子として、リンカーヒストンであるHistone H1を見出した。そこで、H1に対するモノクローナル抗体を作成し、H1とPiwiとの相互作用様式を生化学的に解析した。さらに、PiwiとH1が共通のトランスポゾンを制御対象とし、標的トランスポゾンへのH1の結合量はPiwiに規定されることを示した。また、Piwi-piRNA複合体によるH1を介したトランスポゾンの制御がこれまでに示唆されてきた抑制性ヒストンマークを介した制御と並行して起こることを明らかにした。これらの結果から、Piwi-piRNA複合体はH1の位置情報を規定することでトランスポゾンを制御するという新たな制御モデルを提唱することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Piwiと核内で複合体を形成するタンパク質を免疫沈降法および質量分析法を用いて解析した結果、リンカーヒストンH1がPiwiと複合体を形成していることを見出した。これを受けて、H1を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を作成し、免疫沈降法を中心とした生化学的な解析をとおしてH1とPiwiの相互作用様式を明らかにした。RNA-seq法を用いてH1およびPiwiが制御するトランスポゾンを網羅的に解析した結果、Piwiによって制御されるトランスポゾンのほとんどは、H1による制御を受けていることが示された。さらに、H1のChIP-seq解析を行い、Piwiをノックダウンすることにで、PiwiおよびH1に制御されるトランスポゾン特異的にH1の結合量が減少することを明らかにした。また、既知のPiwi-piRNA関連因子や抑制性ヒストンマーク（H3K9me3）とH1との関係性を明らかにするために、関連因子ノックダウン条件下でH1等の因子のChIP-seq解析を行った。その結果、H1によるPiwi標的トランスポゾン抑制は、既知のPiwi-piRNA複合体による制御と並行して起こっている可能性を見出した。これらのことから、Piwiは抑制性ヒストンマークとリンカーヒストンH1の両者を制御することにより、標的トランスポゾンの抑制を行っているという新たな制御モデルが提唱された。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果から、Piwi-piRNAとHistone H1が相互作用することが見出された。一方で、H1以外の新規Piwi-piRNA複合体構成因子の同定も免疫沈降により試みたが、現段階で新規因子を同定することは出来ていない。そこで、今後は異なるアプローチを用いてPiwi-piRNA複合体が作用する核内タンパク質の同定を試みる。具体的には、クロマチンプロテオーム解析というクロマチン結合タンパク質を網羅的に同定する方法 [Kustatscher et al. Nat Protoc (2014)] を用いる。Piwiノックダウン時にクロマチン結合量が変動するタンパク質を同定し、これがPiwiと複合体を形成する可能性を検討する。これと並行して、これまでの解析結果を検証するために、人工piRNA産生系を用いて核内Piwi-piRNA複合体作用プロセスを解析する。これまでに、培養細胞を用いて人工的にpiRNAを産生する実験系を構築した [Ishizu et al. Cell Rep (2015)]。この実験系は、本来piRNAが標的としない任意のゲノム領域を標的とするpiRNAを発現させることが出来る。したがって、piRNA産生に伴いH1を含む関連因子が人工的に作成されたpiRNA標的領域にリクルートされる様子をChIP法により確認する。
上記はPiwi-piRNA複合体の構成因子とそれらの関係性を明らかにすることを目的としている。これに加え、Piwi-piRNAが作用するRNA/DNA領域を明らかにすることで、Piwi-piRNA複合体による制御の全容解明を目指す。具体的には、クロスリンクRNA免疫沈降法（CLIP法）およびChIP-seq法／DamID法を用いて、Piwiが結合するRNA/DNA領域を解析する。さらに、モチーフ検索等の情報学的手法を用いて、Piwi-piRNA複合体による標的認識の法則性の抽出を試みる。これにより、Piwi-piRNA複合体の標的認識エレメント及び機能プラットフォームを解明する。
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[Journal Article] piRNAs derived from ancient viral processed pseudogenes as transgenerational sequence-specific immune memory in mammals2015
Author(s)
Parrish NF, Fujino K, Shiromoto Y, Iwasaki YW, Ha H, Xing J, Makino A, Kuramochi-Miyagawa S, Nakano T, Siomi H, Honda T, Tomonaga K
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Journal Title
RNA
Volume: 21
Pages: 1691-1703
DOI
Peer Reviewed
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