2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of Fluorescent Probes with Molecular Evolution Engineering
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15H05723
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中井 淳一 東北大学, 歯学研究科, 教授 (80237198)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根本 直人 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60509727)
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| Project Period (FY) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 脳機能プローブ / 蛍光 / 分子進化 / 分子認識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
機能的アプタマーを用いた蛍光プローブ開発、および、ランダム配列を持つアプタマーを用いた蛍光プローブ開発について、本研究は従来のペプチドアプタマーライブラリーより分子量において、各段に大きなライブラリーを構築するものであるため、各ステップで効率を落とさないように反応系を最適化する必要があることがわかってきた。そこで、長鎖の蛍光プローブ作成を可能にする技術の確立を目指して、a)翻訳効率を向上させる。b)mRNAの分解を抑制する。c)mRNAとピューロマイシンの連結効率を向上させる。の3点に関して検討を行った。ウサギ網状赤血球由来の無細胞翻訳系、小麦胚芽を翻訳酵素源とする無細胞翻訳系、および大腸菌の翻訳系を試験管内で再構築した無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を合成し、その効率の最適化に取り組んだ。また、数種類の5' untranslational regionのタンパク合成に対する影響の検討も行った。さらに、翻訳活性の阻害を回避し、翻訳効率を最適化するためRNaseインヒビターの濃度や反応条件の検討、反応系の塩濃度や反応時間などの条件を検討した。その結果、これまでのタンパク合成の数倍の効率向上を達成することができた。高速スクリーニング法の確立：酵母ディスプレイ法を導入した。さらに作成した酵母ディスプレイをセルソーターを用いた高速スクリーニング可能か検討した。実験は順調に進み、酵母ディスプレイを高速により分け、スクリーニングできることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
機能的アプタマーを用いた蛍光プローブ開発およびランダム配列を持つアプタマーを用いた蛍光プローブ開発には、従来のペプチドアプタマーライブラリーより各段に大きな分子量のライブラリーを構築するため、各ステップで効率を最大限に高める努力が必要であり、そのため反応系を工夫している段階である。本年度、長鎖の蛍光プローブ作成を可能にする技術の確立を目指して、動物由来の無細胞翻訳系、植物由来の無細胞翻訳系や大腸菌の翻訳系を試験管内で再構築した無細胞タンパク質合成系を用いて最適化に取り組んで、一定のタンパク合成効率化が確認されたが、量的にはさらに増やせる余地があり、RNAの安定性などの点で条件検討を行う必要がある。高速スクリーニング法の確立では、新たに導入した酵母ディスプレイを用いた高速スクリーニング法が順調に進んでいる。セルソーターによる篩い分けも成功しており、期待が持てる。
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| Strategy for Future Research Activity |
機能的アプタマー開発では、プローブの合成効率化に取り組んでいく必要がある。ライブラリーの翻訳効率化では、特に長鎖のプローブを作成が重要であることがわかってきたことから、長鎖プローブを作成する技術の確立を目指す。また、スクリーニン技術に関して、酵母スクリーニングではより効率的なスクリーニングを開発する必要があるので、酵母スクリーニングの効率化の検討を行っていく。
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[Presentation] Integrating Neuronal Ensembles Constitute and Replay Hippocampal Engram2018
Author(s)
Ghandour K, Ohkawa N, Alan Fung C C, Asai H, Saitoh Y, Takekawa T, Okubo-Suzuki R, Soya S, Nishizono H, Matsuo M, Sato M, Ohkura M, Nakai J, Hayashi Y, Sakurai T, Osanai M, Kitamura T, Fukai T, Inokuchi K
Organizer
神経科学大会
Int'l Joint Research
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[Presentation] 広視野二光子顕微鏡による単一細胞解像度のIn vivoイメージング2018
Author(s)
太田桂輔, 大石康博, 鈴木崇之, 伊東翼, 大泉匡史, 小田川摩耶, 松原智恵, 小林碧, 大出孝博, 小林憲太, 大倉正道, 中井淳一, 宮脇敦史, 青西亨, 村山正宜
Organizer
神経科学大会
Int'l Joint Research
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[Presentation] G-CaMP6トランスジェニックマウスを用いたin vivoカルシウムイメージングによる腸管神経系の機能解析2018
Author(s)
茂木優貴, 佐藤正晃, 堀口和秀, 大倉正道, 安藤恵子, 池谷裕二, 房前裕順, 本郷良泳, 鈴木稔, 小川公一, 高木都, 中井淳一
Organizer
生理学研究所研究会 心臓・血管系の頑健性と精緻な制御を支える分子基板の統合的解明
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[Presentation] Orchestrated ensembles activity constitute hippocampal memory engram2018
Author(s)
Ghandour K, Ohkawa N, Fung C A, Asai H, Saitoh Y, Takekawa T, Okubo-Suzuki R, Soya S, Nishizono H, Matsuo M, Osanai M, Sato M, Ohkurfa M, Nakai J, Hayashi Y, Sakurai T, Kitamura T, Fukai T, Inokuchi, K
Organizer
Neuroscience 2018
Int'l Joint Research
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[Presentation] G-CaMP6トランスジェニックマウスを用いた生体カルシウムイメージングによる腸管神経系の解析2018
Author(s)
茂木優貴, 佐藤正晃, 堀口和秀, 大倉正道, 安藤恵子, 池谷裕二, 房前裕順, 本郷良泳, 鈴木稔, 小川公一, 高木都, 中井淳一
Organizer
筋生理の集い
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[Presentation] G-CaMP6トランスジェニックマウスを用いた生体腸イメージング実験法2018
Author(s)
茂木優貴, 佐藤正晃, 堀口和秀, 大倉正道, 安藤恵子, 池谷裕二, 房前裕順, 本郷良泳, 鈴木稔, 小川公一, 高木都, 中井淳一
Organizer
生理学東京談話会
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