2015 Fiscal Year Annual Research Report
ミトコンドリア内への過剰なＣａ２＋流入を感知・抑制する蛋白質複合体の構造生物学
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15J40096
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
真板 綾子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2015-07-29 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛋白質複合体 / X線結晶構造解析 / ミトコンドリア / カルシウム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
所属研究室で見出したミトコンドリアへの過剰なCa2＋取り込みの制御HAX-1-UCP3複合体に着目し、X線回折法を用いて、この複合体の構造機能相関研究を行った。これまでに、HAX-1とUCP3の相互作用領域がそれぞれ、C末端側領域（211-280）とミトコンドリア内腔に存在する膜間ループ2領域(165-175)であること及び両者の結合にはCa2+の存在が必須であること明らかにしている。また、HAX-1に関しては、Ca2+と直接結合すること及びその結合により大きな構造変化が誘起されることを明らかにした。これらの結果より、HAX-1（211-280）のCa2+結合を介した大きな立体構造変化がミトコンドリア内のCa2+濃度上昇の感知とUCP3との結合に関与している可能性が示唆された。そこで、この複合体が如何にしてCa2+の取り込みを制御しているかを明らかにすることを目的とし、初年度はX線回折法よるHAX-1（211-280）単体及びUCP3ペプチドとの共結晶構造解析を目指した。まず、HAX-1の大量発現・精製を行い、様々な結晶化スクリーニングキットを用いて、単独及びUCP3ループ2ペプチドとの共結晶化を行った。この過程で、蛋白質を安定化するために添加していた界面活性剤CHAPSが、結晶化ドロップ内で相分離を引き起こすことがわかった。そこで、他の界面活性剤DDMに変えて精製を行ったところ、1L当たりの精製蛋白量が約10倍に増え、結晶化ドロップ内の相分離問題も解決できた。興味深いことに、CHAPSとDDMでミセルサイズが異なることにより、ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターンから、界面活性剤のミセルと直接結合することが明らかになった。また、幾つかの条件で結晶が得られ、そのうちの代表的な結晶に関しては、SDS電気泳動・銀染色の結果から、蛋白質由来のものであることを確認した。さらに、大型放射光施設SP-8で回折実験を行ったが、残念ながら構造解析可能な回折データは得られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
私は産後休暇による研究中断のため、当該年度の7/1から本研究を開始した。X線回折法によるHAX-1-UCP3複合体の構造研究を進めた。対象とするHAX-1は膜結合性を示すため、試料調製が難しい蛋白質であるが、結晶化のための大量発現・精製系の確立、様々な種類の結晶化条件の探索を網羅的に行った。複合体の構造決定まで至っていないが、三年計画の初年度であり、着実にゴールに向かって進めており、概ね計画どおりに進んでいると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度も引き続き、HAX-1211-280単体及びUCP3ペプチドとの共結晶化条件の探索を行う。研究を行う過程で、HAX-1211-280は、ミトコンドリア内膜に結合する可能性が示唆された。そこで、膜タンパク質の変性を防ぐ脂質キュービック相（LCP)法による結晶化及びゲル中での結晶化等の膜タンパク質に適した結晶化条件探索を行う。良好な結晶が得られれば、X線回折実験・構造決定を行う。X線回折法による構造解析がうまくいかない場合には、NMR法による構造解析も試みる。
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[Journal Article] Structural analysis of the TKB domain of ubiquitin ligase Cbl-b complexed with its small inhibitory peptide, Cblin2016
Author(s)
Ohno A. Ochi A., Maita N., Ueji. T., Bando A., Nakao R., Hirasaka K., Abe T., Teshima-Kondo S., Nemoto H., Okumura Y., Higashibata A., Yano S., Tochio H., Nikawa T
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Journal Title
Archives of Biochemistry and Biophysics.
Volume: 594
Pages: 1-7
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] UCP3 is associated with HAX-1 in mitochondria in the presence of calcium ion.2016
Author(s)
Hirasaka K., Mills E. M., Haruna M., Bando A., Ikeda C., Abe T., Kohno S., Nowinski S. M., Lago C. U., Akagi K., Tochio H., Ohno A., Teshima-Kondo S., Okumura Y., Nikawa T.
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Journal Title
Biochemical and Biophysical Resarch Communications
Volume: 472
Pages: 108-113
DOI
Peer Reviewed
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