2015 Fiscal Year Research-status Report
骨代謝と糖代謝をつなぐシグナル蛋白質オステオカルシンの構造と機能
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15K01805
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| Research Institution | Chitose Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
河野 敬一 千歳科学技術大学, 理工学部, 特別研究員 (10136492)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | オステオカルシン / 多臓器相関 / ハイドロキシアパタイト / 吸着 / 糖代謝 / 立体構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オステオカルシン（OC）は骨芽細胞で作られ、骨形成に関与する蛋白質として認識されてきた。最近、OCが膵臓のβ細胞に対してホルモンとして働き、糖代謝をも制御することが提案され、再び脚光を浴びている。
OCはγカルボキシグルタミン酸（Gla）と呼ばれるカルシウムイオンにキレート配位する残基をもっている。骨中ではOCはGla型で存在するが、破骨細胞による骨吸収の際には、ハイドロキシアパタイト（HA）を溶解するために酸が分泌され、酸性環境でOC中のGla残基は脱炭酸してGluになる。これが吸収されて血中ではホルモン活性をもつGlu型のOCが存在する。
血中には破骨細胞の酵素によってArg19-Arg20の間が切断されたフラグメントが存在する。Ca配位Gla型OCの立体構造はX線結晶解析やNMRによって解かれている。それによればArg19-Arg20周辺はヘリックス構造をとっており、酸性のGla型OCが同様の構造をとっているとすれば、切断が困難となる。その結果切断フラグメントではなく、活性型ホルモンであるGlu型OCの血中濃度が上昇することから、酸性Gla型OCの立体構造を明らかにすることは重要である。ウシOCの天然評品について、酸性Gla型OCのNMRによる立体構造の予備的な結果は我々によって得られていたが、ウシの合成評品を調製し純度の高い試料による構造解析を進めている。
一方、ホルモン活性を示すGlu型OCの立体構造も最近X線結晶解析によって解かれたが、これまでの立体構造を持たないという予想に反してGla型OCに類似した構造をとっていることが示された。溶液中でもGlu型OCがGla型OCに類似した構造をとるかはホルモン活性発現機構と関連して重要である。ウシとマウスの合成評品を調製し純度の高い試料による構造解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Gla型OCは、Caイオンと結合していないときランダム構造をとるが、Caイオンと結合すると立体構造を形成すると言われてきた。一方、最近の我々のNMRによる酸性状態のGla型OC（Caイオンは外れている）の予備的な研究によれば、酸性状態ではCaイオン結合状態と同じ程度に構造形成していることがわかっている。
現在は、固相合成によって得られたウシとマウスの還元型OCを酸化してジスルフィド結合を形成させ、架橋反応の進捗を逆相HPLCによって確認するとともに、高純度の酸化型OC評品を得る作業を行っている。
構造解析の第一段階としてCDスペクトルのpH変化および熱変性過程の解析を進めており、熱力学パラメーターの算定を行った。ペルチェ式温度可変セルホルダーを用いることで精密な変性曲線を効率よく取得するシステムを構築した。
骨由来ホルモンとして重要なGlu型OCであるが、これまで溶液中では構造をもたないと考えられてきた。最近のＸ線結晶解析によるGlu型OCのCa配位Gla型OC類似の構造は結晶場の束縛による可能性があり、Glu型OCは溶液中では揺らいだ構造をとっていることが予想される。構造形成を促進するTFE等を加えることによるスペクトル変化の解析から構造形成の取りやすさ（intrinsic helical propensity）の解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
酸性状態でのGla型OCおよびGlu型OCの構造解析では、CD測定を継続し、NMR測定を加えることで精密な構造を得る。
Ca配位Gla型OCのHAに対する吸着構造がＸ線結晶解析の結果から提唱されているが、飽くまでもモデルであり、実験的な根拠はない。また、HAのどの結晶面にOCが結合するか全く分かっておらず、antifreeze protein等の解析の進んでいる蛋白質に比べてOCの重要性にもかかわらず研究が進んでいない。骨形成の制御に関わっているとされるOCの機構を理解するためにもこの情報は必要である。これを解明することは、骨代謝研究のみならず、HAに吸着したCa配位Gla型OCがホルモンとして活性なGlu型OCに変換される機構を考察する上でも重要である。
OCを蛍光標識し、HAに吸着させて蛍光顕微鏡で観察することによりHAのどの面にOCが吸着するか検討する。Caイオンの代わりに重金属イオンを結合させたOCを調製し、HAに吸着させた後、走査電顕でEDX分析を行うことによりHAのどの結晶面にOCが結合するかを観察する。ラマンスペクトルにより、ハイドロキシアパタイト表面に吸着したCa配位Gla型OCの立体構造情報の抽出を行う。ラマンイメージングによってHAのどの結晶面にOCが結合するかを観察する。
共同研究者が15N標識Glu型OCの調製を進めている。緩和解析により、Ｘ線結晶解析により解かれたGlu型OCの構造が結晶場に束縛されたためのものか、ゆらぎの大きさがどの程度か検証する。
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| Causes of Carryover |
予備実験のためのGlu型オステオカルシンとGla型オステオカルシンの合成を試薬業者に発注したが、納品が年度末になり、当初予定していた本実験のためのGlu型オステオカルシンとGla型オステオカルシンの合成が発注できなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は購入したGlu型オステオカルシンとGla型オステオカルシンの酸化反応と精製を行い本格化する測定に供するため、合成ペプチドの購入が数度に及び、繰り越した予算が消費される見込み。
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[Journal Article] Efficient production of a correctly folded mouse α-defensin, cryptdin-4, by refolding during inclusion body solubilization.2015
Author(s)
Tomisawa S, Sato Y, Kamiya M, Kumaki Y, Kikukawa T, Kawano K, Demura M, Nakamura K, Ayabe T, Aizawa T.
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Journal Title
Protein Expr Purif.
Volume: 112
Pages: 21-28
DOI
Peer Reviewed
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