2015 Fiscal Year Research-status Report
セルロースを原料とするポリマー前駆体であるグルカル酸の新規酵素合成系の確立
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15K06593
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| Research Institution | Osaka Municipal Technical Research Institute |
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Principal Investigator |
桐生 高明 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究主任 (20416308)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村上 洋 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究室長 (10416307)
木曽 太郎 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究主任 (90416313)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | セルロース / グルカル酸 / 糖酸化酵素 / β-グルコシダーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セルロースからポリマー原料として利用可能なグルカル酸を生産する手法を確立するため、セルロースの分解物であるセロオリゴ糖を酸化し、セロオリゴアルドン酸を生産する条件の決定および、セロオリゴアルドン酸を効率よく加水分解するβ－グルコシダーゼの精製とクローニングを行っている。
Paraconiothyrium 属KD3株培養上清を用いたセロオリゴ糖酸化反応条件について検討を行った。グルコースおよびセロビオースからセロテヘキサオースまでセロオリゴ糖に対する相対活性を調べた。セロオリゴ糖の鎖長が長くなっても、培養上清に含まれるCarbohydrate:accepter oxidoreductaseはこれらのオリゴ糖を、良好な基質とされるラクトース並みに、効率的に酸化ですることが分かった。一方、グルコース酸化活性はラクトースの１割に過ぎなかった。酸化反応により生成する過酸化水素により反応効率が低下したが、過酸化水素を分解することで、反応効率の低下を回避できた。さらに、セロビオースを酸化し、セロオリゴアルドン酸を大量調製した。
Penicillium chrysogenum ATCC28089のゲノムデータベースから、β-グルコシダーゼと思われる遺伝子を８種選択、そのうちの3種を発現ベクターに導入し酵母に形質転換し、β-グルコシダーゼ導入酵母の調製を行った。
各種Penicillium属市販酵素剤について、セロビオース分解活性とセロビオン酸分解活性の比較を行った。アマノエンザイム社製の酵素剤はセロビオース分解活性よりセロビオン酸分解活性の方が高いことから、本酵素剤より、目的酵素の精製を行うこととした。硫安沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィーが目的酵素の精製に有効であることが分かった。また、各種、疎水クロマトグラフィー担体による生成を試みたが、いずれの担体も活性が失活してしまうことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Paraconiothyrium 属KD3株培養上清については、反応条件などの検討を行った、課題となっていた、過酸化水素の影響の回避方法も確立するなど、当初の目標をおおむね達成できた。
P.chrysogenum 由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子のクローニングと発現についても複数個のβ-グルコシダーゼ遺伝子を発現ベクターに組込み酵母に形質転換することができた。
市販酵素剤からの、セロビオン酸を効率的に分解するβ-グルコシダーゼの精製につても酵素剤の選択および精製条件を確立しつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は当初の計画どおりに研究を進める。具体的には、Paraconiothyrium 属KD3株由来の酸化酵素、COX遺伝子のクローニングを行い、その塩基配列を明らかにする。すべてのP.chrysogenum 由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子の酵母での発現を目指す。さらに、市販酵素剤からのβ-グルコシダーゼの精製を行うとともに、部分精製したβ-グルコシダーゼを用いたセロビオン酸に対する分解反応の諸条件について明らかにする。
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| Causes of Carryover |
予定より旅費が安くついたため。18,764円の未使用額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
来年度の消耗品等に使用する。
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[Presentation] ステロイドホルモン類に対する糖転移2016
Author(s)
木曽太郎，安居弘樹, 湯口宜明, 桐生高明, 村上 洋, 中野博文
Organizer
日本農芸化学会2016年度大会
Place of Presentation
札幌コンベンションセンター（札幌市）
Year and Date
2016-03-29 – 2016-03-29
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