2016 Fiscal Year Research-status Report
アデノウイルスベクター及びCRISPRを用いた受精卵における遺伝子組換えの効率化
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15K06807
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
吉田 哲 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (00365438)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三谷 幸之介 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10270901)
汲田 和歌子 公益財団法人実験動物中央研究所, 応用発生学研究センター, 研究員 (50549128)
徳永 暁憲 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, その他部局等, 室長 (70549451)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マーモセット / ノックイン / CRISPR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
従来、ノックイン動物を用いる際はES細胞にターゲッティングベクターを導入し、ノックインされたことにより薬剤耐性になったものを選択することにより選別する方法が採用されてきた。しかし、ES細胞の性質の違いにより、この方法はマウスでのみ可能であり、マウス以外の動物に用いることはできない。そこで、マウス以外の動物においてノックインを作成する場合、CRISPRとドナーDNAを受精卵に導入する方法が採用されている。CRISPRを用いてゲノム中の任意の場所を切断すると、DNA修復機構により、ドナーDNAがゲノムに相同組換えによりノックインされることが知られている。この方法により、哺乳動物においてラット、ブタなどでノックイン動物の作製が報告された。しかしながら、霊長類においてはまだ報告はない。そこで、霊長類に属するマーモセットにおいてノックイン動物の作製を試みるため、現在までに3つの遺伝子座についてCRISPRおよびドナーDNAを作製した。マーモセットにおいて遺伝子ノックインが成功していないのは、受精卵における相同組換えの頻度が低いためであると考え、現在マーモセットES細胞を用いて組換えの頻度を上昇させる遺伝子の探索を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ドナーDNAをアデノウイルスベクターに搭載して、CRISRPと共に目的の細胞に導入することにより、効率よくドナーDNAがノックインされることが報告されている(Holkers et al., Nat Methods, 2014)。これは、アデノウイルスゲノムの構造、すなわち直鎖状２本鎖DNAの両端にタンパク質が共有結合しているもの、によりランダムインテグレーションが抑制されるためであると推測されている。そこで、ドナーDNAと共にCRISPRを搭載したアデノウイルスを受精卵に感染される計画を立てた。しかし、近年、CRISPR/Cas9の発現が遅いと、受精卵の発生が進んだ際、割球ごとにゲノム状態が異なるいわゆるキメラ胚が多く認められるという報告があり、Cas9はタンパク質の状態で受精卵に導入する方法が趨勢となってきている。そこで、方針を変更し、現在、アデノウイルスの中に相同組換えを促進する遺伝子が存在すると考え、アデノウイルスの遺伝子の発現ベクターを作製し、マーモセットES細胞にCRISPR、ドナーDNAと共に導入し、それらの遺伝子のスクリーニングを行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、マーモセットES細胞を用いて、アデノウイルスにコードされた相同組換えを促進する遺伝子のスクリーニングを行っている。確認が必要ではあるが、目的の遺伝子が取れつつある状態である。これらの遺伝子について、マーモセットES細胞以外の細胞株やマウス受精卵でも相同組換えを促進する活性があるかどうかを確認する予定である。活性が確認されたら、マーモセット受精卵についても調べる。マーモセット受精卵において、３割以上の確率でノックインが観察された場合、胚移植を行いノックインマーモセットの作製を試みる。
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| Causes of Carryover |
昨年度、マウス受精卵にCRISPRとドナーDNAをコードしたDNA搭載したアデノウイルスベクターを導入する研究計画を立てていたが、CRISPR/Cas9についてはタンパク質を直接導入することになったため、マウス受精卵を用いた実験ができなかった。その結果、計画していたほどの金額を消費することなく終わった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は、最近取れてきた組換え頻度を上昇させるアデノウイルス由来遺伝子が受精卵においても機能するかどうかをマウス受精卵を用いて実験するため、昨年度使用できなかった分の金額を当てるつもりである。また、マーモセット受精卵への導入や、その胚移植も行う予定であるため、1820,000円は全額使用する予定である。
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