2016 Fiscal Year Research-status Report
ゲノムDNA上に生じた一分子の付加体の測定方法の開発
| Project/Area Number |
15K06849
|
|---|
| Research Institution | Toyo University |
|---|
Principal Investigator |
椎崎 一宏 東洋大学, 生命科学部, 准教授 (20391112)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | DNA付加体 / 第三世代シークエンサー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
化学物質によるDNA付加体は遺伝子変異を引き起こし、その変異がクリティカルな部位に生じれば発がんの原因となる。第Ⅲ世代シーケンサーを用いた配列解析において、DNA付加体のような修飾塩基が存在するとポリメラーゼ伸長反応が遅延する。これまでの検討で、この伸長反応の遅延によって一分子のDNA付加体の部位を検出することが可能であることが分かった。DNA中に1塩基のO6-Methyl-2'-deoxyguanosineを持つ二本鎖DNAを作成し、PucBio社RSIIシークエンサーによって解析した。個々のDNA付加体に対する伸長遅延をリード別に解析したところ、遅延率は一定ではなく、平均から1/10から10倍程度の開きを持って正規分布していることが分かった。このことから、DNA上の付加体検出は可能だが付加体の種類を伸長遅延率で判定することは難しいと考えられた。さらにこの方法での検出感度を検討するために、付加体を持つDNAフラグメントを通常のDNAフラグメントと混合して検出を試みたところ、検出限界は一割以上付加体付きDNAが存在していないと検出ができないことが分かった。検出感度の低さの原因はハードウェア側ではなく、付加体を持つDNAの解析結果がカバレッジの低さなどの理由で解析から自動排除されている可能性が考えられた。このため、各種解析パラメーターをチューニングしたところ、1%前後の混合比であれば解析可能であることが分かった。しかしながらDNA付加体の形成割合は1/1000000程度であり、全ゲノム中にわずかしか含まれていないDNA付加体の濃縮方法の開発が今後の課題である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
第Ⅲ世代シークエンサーを用いた通常の一分子シークエンスとしての利用法から逸脱した使用方法を行っているため、付加体検出のためのデータ解析が困難であると考えられたが、バイオロジー関連メガデータ解析を専門としている業者にデータ解析の協力を仰ぎ、パラメーターをチューニングすることで検出感度の上昇を実現することができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
付加体検出率が1%程度であることが判明したため、今後は付加体を持つDNAフラグメントの濃縮を行う必要がある。方法としてはDNA付加体特異的な抗体を用いたキャプチャーを行い、濃縮効率についてリアルタイムPCR法による定量的評価を行うことを計画している。
|
| Causes of Carryover |
今年度は、シークエンスデータの解析が主体となり、ウェット実験に係る試薬等の支出が当初計画より少なかったため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度はデータ解析のための機器（ハードディスク、PC購入など）および、抗体や細胞培養に関わる試薬類が必要であるため、当該年度で生じた繰り越し額を全て使用する予定である。
|
