2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒト多能性幹細胞におけるオフターゲット効果の少ない効率的なゲノム編集技術の開発
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15K06924
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
曽根 岳史 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任助教 (00379091)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / iPS細胞 / CRISPR / ノックイン / ウイルスベクター / 遺伝子治療 / 相同組換え / 疾患研究 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集技術の発展に伴い、ゲノムの任意の標的遺伝子を特異的に切断するTALENやCRISPR/Casを発現するためのベクターには様々な改良が施されてきた一方で、供与核酸としての標的組換えベクターの構築が次なるボトルネックとなってきている。
本研究では、まず平成27年度は、この標的組換えベクターを簡便に構築する方法を考案し確立した。さらにこの方法で構築した標的組換えベクターと標的遺伝子を切断するTALENを電気穿孔法によって導入することで、ドラベ症候群、家族性ALS、ペンドレッド症候群、家族性パーキンソン病の患者由来のiPS細胞等でその疾患の原因となっている遺伝子(それぞれSCN1A、FUS、SLC24A6、LRRK2)を修復したり、逆に正常なiPS細胞に患者由来の変異を導入したりすることに成功し、その成果を複数の国内および国際学会やFUS, SLC24A6については、それぞれStem Cell Reports誌、Cell Reports誌で論文発表した。
平成28年度は、CRISPR発現ベクターの改良にとりくみ、ヒトiPS細胞への導入効率の低さを補うために、アデノウイルスや挿入欠失型レンチウイルスなどのベクター骨格に簡便に乗せ換えることが可能な系を構築し、実際にゲノム編集に使用可能かどうか試みた。挿入欠失型レンチウイルスについては容量の限界からか十分な力価が上がらず、アデノウイルスについては、力価は十分高いものの、ヒトiPS細胞でもコントロールの293T細胞でも標的切断は確認できなかった。しかし、この系の副産物として、通常のプラスミドベクター上に最大で4つまでのgRNAとCas9を同時に発現させるall-in-oneベクターが構築可能であることが分かり、これと薬剤選抜可能な標的組換えベクターをリポフェクション法で導入することで効率よくゲノム編集が可能であることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画においては、平成28年度は標的組換えベクター系の構築とともに、ヒトiPS細胞へ高効率でゲノム編集ベクターを遺伝子導入するために、CRISPRタンパク質発現ベクターや標的組換えベクターをアデノウイルスや挿入欠損型レンチウイルスに載せる系の構築を目標としていたが、ベクターのウイルス化によって見た目の遺伝子導入効率が上がっても、薬剤選抜等により遺伝子導入細胞を濃縮しない限り、標的ゲノム切断は確認できておらずウイルス化の意義が怪しくなりつつあることから研究計画が完璧に進んでいるとは言えない。
一方で副産物として構築した複数のgRNAを同時発現可能なCRISPR発現プラスミドベクターは、平成27年度に構築系を確立させた薬剤選抜型の標的組換えベクターとの組み合わせによって家族性パーキンソン病、細胞増殖と腫瘍化、アンジェルマン症候群、多系統萎縮症の原因遺伝子(それぞれPARK2、TPT1、UBE3A)のノックアウト株の樹立が成功し、多系統萎縮症のリスク因子や、神経フェリチン症、家族性ALSの原因遺伝子（それぞれ、COQ2、FTL、SOD1）の変異修復・導入株の樹立にも成功しており、当初想定していなかった成果を得つつあるためこの評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画ではウイルス化することにより遺伝子導入効率が上がれば、薬剤選抜等による濃縮を行わなくともゲノム編集株を取得できると考えていたが、現状では薬剤選抜を行う方が圧倒的に効率がよいことが示されてきた。そこで、本研究の前半で確立した薬剤選抜用標的組換えベクターの簡易構築系をさらに活かして複数の薬剤で確実に両アレルをゲノム編集し、確実にホモ編集株、ヘテロ編集株が得られる方法、all-in-one型CRISPR発現ベクターとの組合せによって導入効率が低くても確実に目的のゲノム編集を成功させることが可能な方法などをこれまでの遺伝子で成功した具体例等とともに示して方法論の論文としてまとめることにする。また、1年目、2年目ではあまり踏み込むことができなかったオフターゲット効果の問題についてもDouble Nickase型Cas9を用いて得たゲノム編集株と野生型Cas9、改良型Cas9を用いて得たゲノム編集株について、予想されるオフターゲット配列近辺やExome解析による標的以外のコーディング領域への変異の有無を調べることで両者のメリット・デメリットを示していく。
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| Causes of Carryover |
平成27年度に引き続いて平成28年度においては研究計画の進行状況を鑑みて、ゲノム編集株の次世代シークエンス解析を割愛したためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
様々な方法で樹立したゲノム編集株がそろい、次世代シークエンス解析費用も下がってきた今年度においてまとめて次世代シークエンス解析を行うことでゲノム編集方法とオフターゲット効果について一括して解析を行う。
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[Presentation] 遺伝性パーキンソン病患者由来iPS細胞におけるゲノム編集iPS細胞の樹立2017
Author(s)
太田 悦朗, 曽根 岳史, 大日方 友理, 鵜飼 英樹, 久松 知子, 北川 季子, 石川 充, 駒野 肇, 上田泰己, 小幡 文弥, 岡野 栄之
Organizer
第16回日本再生医療学会総会
Place of Presentation
仙台国際センター, 仙台
Year and Date
2017-03-07 – 2017-03-09
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[Presentation] ゲノム編集によるポリグルタミン病の病態解析と治療開発の可能性2016
Author(s)
田中 智史, 伊藤 卓治, 太田 明伸, 曽根 岳史, 下門 大祐, 小野寺 一成, 今釜 史郎, 細川 好孝, 道勇 学, 勝野 雅央, 祖父江 元, 岡野 栄之, 岡田 洋平
Organizer
第39回分子生物学会年会
Place of Presentation
パシフィコ横浜, 横浜
Year and Date
2016-11-30 – 2016-12-02
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[Presentation] 遺伝性パーキンソン病患者由来iPS細胞におけるゲノム編集iPS細胞の樹立2016
Author(s)
大日方 友理*, 太田 悦朗, 曽根 岳史, 鵜飼 英樹, 久松 知子, 石川 充, 駒野 肇, 上田 泰己, 小幡 文弥, 岡野 栄之
Organizer
第11回日本臨床検査教育学会学術大会
Place of Presentation
神戸常盤大学・神戸国際展示場, 神戸
Year and Date
2016-08-31 – 2016-09-02
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[Presentation] 遺伝性パーキンソン病患者由来iPS細胞のゲノム編集および病態解析2016
Author(s)
太田 悦朗*, 曽根 岳史, 大日方 友理, 鵜飼 英樹, 久松 知子, 北川 季子, 石川 充, 駒野 肇, 上田 泰己, 小幡 文弥, 岡野 栄之
Organizer
第39回日本神経科学大会
Place of Presentation
パシフィコ横浜, 横浜
Year and Date
2016-07-20 – 2016-07-22
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[Presentation] Establishment of in vitro FUS-associated familial amyotrophic lateral sclerosis model using human induced pluripotent stem cells2016
Author(s)
Naoki Ichiyanagi*, Koki Fujimori, Masato Yano, Chikako Ishihara-Fujisaki, Takefumi Sone, Tetsuya Akiyama, Yohei Okada, Wado Akamatsu, Takuya Matsumoto, Mitsuru Ishikawa, Yoshinori Nishimoto, Yasuharu Ishihara, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Hitomi Tsuiji, Naoki Suzuki, Hitoshi Warita, Masashi Aoki, Hideyuki Okano
Organizer
ISSCR 2016 Annual Meeting
Place of Presentation
San Francisco, CA
Year and Date
2016-06-22 – 2016-06-25
Int'l Joint Research
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