Development of genome editing technology with low off-target risk and high efficiency in human pluripotent stem cells

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K06924
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 曽根 岳史 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 訪問研究員 (00379091)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / iPS細胞 / CRISPR / ノックイン / TALEN / 遺伝子治療 / 相同組換え / 疾患研究

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、ゲノム編集技術の発展で次なるボトルネックとなっている標的組換えベクターの効率的な構築方法を考案して確立し、TALEN発現ベクターおよびCRISPR発現ベクターと共導入することで、様々な疾患患者由来のiPS細胞で原因遺伝子の修復や、正常なiPS細胞に変異導入を成功させてきた。当初は発現ベクターや標的組換えベクターをゲノム挿入の無い挿入欠損型レンチウイルスベクターに載せることによる効率の向上を狙ったが、挿入欠損型レンチウイルスベクターでは感染力価が上がらず目的を達成することが困難であった。そこで平成29年度は、CRISPR発現ベクターの改良で、ベクター上に4つまでのgRNAとニッケース型Cas9を搭載したall-in-oneベクターの簡便構築法を考案し、これと2種の異なる薬剤選抜可能な標的組換えベクターをリポフェクション法で共導入することで、2倍体のゲノム上の2か所をオフターゲット切断のリスク低く同時切断し、簡単にホモノックイン株を樹立可能な系を完成させた。標的組換えベクターとしてはPiggybacトランスポゾンで薬剤選抜カセットを除去する系を採用し、最終的なゲノム編集産物の外来配列を最小限にできる。この系を使って統合失調症のリスク遺伝子(DISC1)にリスク要因となる2種の点変異を導入した株を樹立した。このDISC1の変異導入はゲノム上で約50 kb離れた２つのエクソンにまたがるコドンを一度に変換するもので、通常実施されるssODNによる点変異導入では2回のゲノム編集が必要だが、2つのエクソンを予め融合した供与核酸を載せた標的組換えベクターによって一度で変換することに成功した。また平成27年度に樹立したLRRK2遺伝子ゲノム編集株についてエクソーム解析を実施したが、表現型解析に影響を与えるエクソン部位のオフターゲット変異はみつからず、系の安全性も確認された。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Johns Hopkins University(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Johns Hopkins University
• [Journal Article] Generation of D1-1 TALEN isogenic control cell line from Dravet syndrome patient iPSCs using TALEN-mediated editing of the SCN1A gene (2018)
  • Author(s): Tanaka Yasuyoshi、Sone Takefumi、Higurashi Norimichi、Sakuma Tetsushi、Suzuki Sadafumi、Ishikawa Mitsuru、Yamamoto Takashi、Mitsui Jun、Tsuji Hitomi、Okano Hideyuki、Hirose Shinichi
  • Journal Title: Stem Cell Research Volume: 28 Pages: 100～104
  • DOI: 10.1016/j.scr.2018.01.036
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Down-regulation of ghrelin receptors on dopaminergic neurons in the substantia nigra contributes to Parkinson’s disease-like motor dysfunction (2018)
  • Author(s): Suda Yukari、Kuzumaki Naoko、Sone Takefumi、Narita Michiko、Tanaka Kenichi、Hamada Yusuke、Iwasawa Chizuru、Shibasaki Masahiro、Maekawa Aya、Matsuo Miri、Akamatsu Wado、Hattori Nobutaka、Okano Hideyuki、Narita Minoru
  • Journal Title: Molecular Brain Volume: 11 Pages: [6]
  • DOI: 10.1186/s13041-018-0349-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Functional analysis of synaptic gene expression and morphologies in Angelman syndrome patient-derived neurons (2017)
  • Author(s): Mitsuru Ishikawa, Ryotaro Okochi, Hironobu Okuno, Shoma Tanaka, Takefumi Sone
  • Organizer: CDB Symposium 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Generation of gene-corrected iPSC from patient-derived iPSC with familial Parkinson's disease (2017)
  • Author(s): Etsuro Ohta, Takefumi Sone, Yuri Obinata, Hideki Ukai, Tomoko Hisamatsu, Tokiko Kitagawa, Mitsuru Ishikawa, Hajime Komano, Hiroki R. Ueda, Fumiya Obata, Hideyuki Okano
  • Organizer: ISSCR 2017 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Multisite Gatewayクローニング技術に立脚した汎用ヒトiPS細胞ゲノム編集ツールボックス (2017)
  • Author(s): 曽根 岳史, 吉松 祥, 塩澤 誠司, 大河内 遼太郎, 石川 充, 木下 実結, 藤森 康希, 川嶋 志保子, 大多 茂樹, 鐘ヶ江 裕美, 三好 浩之, 岡野 栄之
  • Organizer: 日本ゲノム編集学会第2回大会
• [Presentation] Pathophysiological analysis of skeletal muscles in spinal bulbar muscular atrophy (SBMA) by genome editing of CAG repeats. (2017)
  • Author(s): Satoshi Tanaka, Takuji Ito, Akinobu Ota, Takefumi Sone, Daisuke Shimojo, Shiro Imagama, Yoshitaka Hosokawa, Manabu Doyu, Hideyuki Okano, Yohei Okada
  • Organizer: Neuroscience 2017 (SfN’s 47th Annual Meeting)
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] ドラベ症候群iPS細胞モデルを用いた創薬ハイスループットスクリーニングシステムの確立に向けた基盤研究
  • URL: https://fukuoka-u.repo.nii.ac.jp/?action=repository_uri&item_id=3996&file_id=22&file_no=1