金属耐性に関わる輸送体膜タンパク質の構造基盤の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06972
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 田中 良樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (10632333)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: タンパク質 / イオン輸送 / 膜タンパク質 / X線結晶構造解析 / 構造生物学

Outline of Annual Research Achievements

金属イオンは生命活動に必須であり，細胞質の金属イオン濃度は厳密に制御されている．植物細胞においてZn, Fe, Mn, Cdイオンの排出を担い,金属耐性に関わるのがMTPファミリーである．本研究では，高い金属集積能力を有する植物由来のMTPの結晶構造解析と立体構造を利用した機能解析を目指している．大量発現系を構築，結晶化に必要な高純度のサンプル精製系を確立し，LCP法による結晶化を試みた．得られた結晶について放射光施設で回折実験を行ったが，解析可能なデータを得るためには結晶の質・量の改善が必要である．抗体等の結晶化を補助する分子の探索やbicelle法など他の結晶化方法を試して結晶化条件の検討を進めている．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

結晶化に必要な量のサンプルを発現させ，高純度に単離する系を確立した．しかし，構造解析可能な結晶の作成には至っていないため，LCP法・bicelle法・HiLiDe法など膜タンパク質結晶化方法を含め，結晶化スクリーニングを繰り返し行っていく．同時に結晶化の補助になる抗体等の結合分子の探索も行い，共結晶化により結晶化を促進する方法も同時に進行させている．

Strategy for Future Research Activity

大量精製系は完成しているので，結晶化条件の探索を網羅的に行っていく．膜タンパク質用の各種結晶化手法を導入や，結晶化を補助する分子を作成し共結晶化を行う予定である．回折実験は微小結晶からの測定が可能なマイクロフォーカスビームラインSPring-8 BL32XUを用いる．また，状況によってはより強力なX線光源であるX線自由電子レーザーSACLAの利用も検討し，構造決定を目指す．
さらに輸送の各状態の構造を決定し，輸送における構造変化を可視化していく．輸送制御や特異性を認識する部位が輸送体に存在すると考えられており，基質の有無や種類を変更し構造解析を行うことで構造機能相関の解明を目標とする．構造に加えて，機能解析を進める．具体的には人工脂質二重膜へ再構成し，イオンに反応する蛍光色素や電気生理学的手法を用いた解析，過剰発現細胞(酵母・植物培養細胞)の重金属感受性の変化を観察する方法などが考えられる．構造情報に基づく解析を行うことで，一塩基多型による輸送基質変化の仕組みなど,輸送メカニズムの解明を目指す.

Causes of Carryover

初期スクリーニングで得られた結晶から期待していた回折像を得られず，予定していたよりも結晶化以前の小規模スクリーニングを行うことが多かったため．

Expenditure Plan for Carryover Budget

結晶化のための大量のサンプル調製と同時に，結晶化を促進する抗体の作製を行っていくために使用する．

Research Products

• [Journal Article] Crystal structures of SecYEG in lipidic cubic phase elucidate a precise resting and a peptide-bound states (2015)
  • Author(s): Yoshiki Tanaka, Yasunori Sugano, Mizuki Takemoto, Takaharu Mori, Arata Furukawa, Tsukasa Kusakizako, Kaoru Kumazaki, Ayako Kashima, Ryuichiro Ishitani, Yuji Sugita, Osamu Nureki and Tomoya Tsukazaki
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 13 Pages: 1561 1568
  • DOI: 10.1016
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Complete and peptide-bound structures of the Sec translocon (2015)
  • Author(s): Yoshiki Tanaka, Yasunori Sugano, Mizuki Takemoto, Takaharu Mori, Arata Furukawa, Tsukasa Kusakizako, Kaoru Kumazaki, Ayako Kashima, Ryuichiro Ishitani, Yuji Sugita, Osamu Nureki and Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: 新学術領域研究「動的秩序と機能」第4回公開国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 九州大学西新プラザ（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2015-11-22
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 新生膜タンパク質の膜組込み過程の構造生物科学 (2015)
  • Author(s): 田中 良樹
  • Organizer: 新学術領域研究「新生鎖の生物学」 平成27年度第2回班会議
  • Place of Presentation: ほほえみの宿（山形県天童市）
  • Year and Date: 2015-11-14
• [Presentation] Structures of Membrane Protein Insertase YidC (2015)
  • Author(s): Tomoya Tsukazaki, Kaoru Kumazaki, Shinobu Chiba, Mizuki Takemoto, Arata Furukawa, Toshiki Kishimoto, Yasunori Sugano, Takaharu Mori, Yoshiki Tanaka, Yuji Sugita, Koreaki Ito, Ryuichiro Ishitani and Osamu Nureki
  • Organizer: Structural Biological Dynamics: From Molecules to Life with 60 trillion Cells
  • Place of Presentation: 東京大学（東京都文京区）
  • Year and Date: 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cytoplasmic conformational transition of Sec translocon (2015)
  • Author(s): Yoshiki Tanaka, Yasunori Sugano, Mizuki Takemoto, Takaharu Mori, Takamitsu Haruyama, Arata Furukawa, Tsukasa Kusakizako, Kaoru Kumazaki, Ayako Kashima, Ryuichiro Ishitani, Hiroki Konno, Yuji Sugita, Osamu Nureki and Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: 第53回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-13 – 2015-09-15
• [Presentation] 新生膜タンパク質の膜組込み過程の構造生物科学 (2015)
  • Author(s): 田中 良樹, 塚﨑 智也*, 古川新, 菅野泰功
  • Organizer: 新学術領域研究「新生鎖の生物学」 平成２７年度第一回班会議
  • Place of Presentation: 東京工業大学（東京都港区）
  • Year and Date: 2015-06-13