原癌遺伝子Aktによる微小管安定化を介した細胞極性制御メカニズムの解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06990
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 樋口 麻衣子 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特任助教 (30420235)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: Akt / PI3K / 微小管 / 細胞極性 / 細胞運動

Outline of Annual Research Achievements

繊維芽細胞が正しい方向に遊走するためには、細胞外の走化性因子の濃度勾配に応じた前後の極性形成とそれに引き続く細胞極性の維持が重要である。繊維芽細胞の極性維持には細胞前方における微小管の選択的な安定化が重要な役割を果たすと考えられているが、いかなるメカニズムで前方の微小管が安定化されるのかはほとんど明らかになっていない。本研究では、PI3K-Akt1経路が微小管の安定化を介して細胞の前後極性の維持に貢献する可能性について検証を行うことを目的としている。我々はこれまでに、Akt1が微小管を安定化することにより細胞極性の維持に貢献することを示唆する結果を得ており、現在はAkt1による微小管安定化メカニズムの詳細について検討を行っている。Akt1ノックダウン細胞において、微小管動態がどのように変化するのかを検討するため、微小管可視化プローブの１つであるEMTB-GFP発現細胞のライブイメージングを行っている。EMTB-GFP発現細胞を超解像顕微鏡で観察することにより微小管１本１本の観察が可能となってきており、微小管の動的不安定性の４つのパラメーター（growth rate、shrinkage rate、catastrophe frequency、rescue frequency）を計測することを目指している。今後は、微小管動態制御におけるAkt1の作用点について詳細に解析する予定である。また、Akt1を局所的に活性化する系を用いて、Akt1の活性を人為的に操作した時に、微小管動態および細胞極性がどのように変化するのか、ということを検討する予定である。さらに、Akt1が微小管動態を制御するメカニズムについても解析したいと考えている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本課題においては、Akt1による微小管動態制御メカニズムを明らかにするため、微小管可視化プローブの１つであるEMTB-GFPを用いてライブイメージングを行っていた。当初は共焦点顕微鏡を用いた観察を行っていたが、微小管１本１本の動態を詳細に観察することは難しかったため、予定を変更し、超解像顕微鏡を用いることにした。共焦点顕微鏡を用いた観察に時間を費やしてしまった分、当初の計画より遅れてしまったが、現在は超解像顕微鏡を用いることにより、非常に高い解像度で微小管１本１本の動態を観察出来るようになった。今後は、超解像顕微鏡を用いて、Akt1ノックダウン細胞の微小管動態について詳細に観察する予定である。

Strategy for Future Research Activity

微小管可視化プローブ（EMTB-GFP）発現細胞を超解像レベルでライブイメージングすることで、微小管動態制御におけるAkt1の役割について明らかにする。さらに、Akt1を局所的に活性化する系を用いて、Akt1の活性を操作した時の微小管動態および細胞極性の変化を観察する予定である。Akt1を局所的に活性化する系としてCRY2とCIB1の二量体化を青色光の照射依存的に引き起こす手法を用いるため、この系を用いる場合にはEMTB-GFPの観察を同時に行うことは出来ない。そこで、EMTB-mCherry、あるいはtubulin-mCherryなどの微小管を赤色蛍光でラベルするプローブを作製して用いる予定である。また、Akt1が微小管動態を制御するメカニズムとして、EB2/RP1に注目している。EB2/RP1の機能については不明な点が多いため、今後はEB2/RP1ノックダウン細胞における微小管動態についても詳しく解析する予定である。

Causes of Carryover

微小管動態を観察するため、微小管可視化ツールであるEMTB-GFP発現細胞を用意し、共焦点顕微鏡を用いたライブイメージングを行っていた。しかし、共焦点顕微鏡を用いた観察では、微小管１本１本の動態を詳細に観察することは難しかったため、予定を変更し、超解像顕微鏡を用いることにした。共焦点顕微鏡を用いた観察に時間を費やした分、研究は当初の計画より遅れてしまった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現在は、超解像顕微鏡を用いてEMTB-GFPの観察を行うことにより、非常に高い解像度で微小管１本１本の動態を観察出来るようになった。今後は、超解像顕微鏡を用いて、Akt1ノックダウン細胞の微小管動態について詳細に観察する予定である。また、Akt1を局所的に活性化した時の微小管動態についても解析する予定である。さらに、Akt1が微小管動態を制御するメカニズムについても明らかにしたいと考えており、Akt1ターゲット分子候補であるEB2/RP1の機能解析も行う予定である。次年度使用額については、以上の実験を遂行するのに必要な消耗品、設備、備品の購入費用として使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] PDK1-Akt pathway regulates radial neuronal migration and microtubules in the developing mouse neocortex. (2016)
  • Author(s): Itoh, Y., Higuchi, M., Oishi, K., Kishi, Y., Okazaki, T., Sakai, H., Miyata, T., Nakajima, K. and Gotoh, Y.
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 113 Pages: E2955-2964
  • DOI: 10.1073/pnas.1516321113
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research