2017 Fiscal Year Research-status Report
原癌遺伝子Aktによる微小管安定化を介した細胞極性制御メカニズムの解明
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15K06990
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
樋口 麻衣子 立教大学, 理学部, 助教 (30420235)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Akt / 微小管 / 細胞極性 / 細胞運動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
繊維芽細胞が正しい方向に遊走するためには、細胞外の走化性因子の濃度勾配に応じた前後の極性形成とそれに引き続く細胞極性の維持が重要である。繊維芽細胞の極性維持には細胞前方における微小管の選択的な安定化が重要な役割を果たすと考えられているが、いかなるメカニズムで前方の微小管が安定化されるのかはほとんど明らかになっていない。本研究では、PI3K-Akt1経路が微小管の安定化を介して細胞の前後極性の維持に貢献する可能性について検証を行うことを目的としている。我々はこれまでに、Akt1が微小管を安定化することにより細胞極性の維持に貢献することを示唆する結果を得ており、現在はAkt1による微小管安定化メカニズムの詳細について検討を行っている。Akt1ノックダウン細胞において、微小管動態がどのように変化するのかを検討するため、微小管可視化プローブの１つであるEMTB-GFP発現細胞のライブイメージングを行っている。また、我々の用いている系において、微小管を可視化するための別のプローブであるtubulin-GFP、さらには微小管のプラス端に結合するEB1の可視化プローブ（EB1-GFP）も使用出来るようになったため、これらのプローブを用いたライブイメージングも行い、微小管の動的不安定性の４つのパラメーター（growth rate、shrinkage rate、catastrophe frequency、rescue frequency）を計測することを目指している。また、Akt1が微小管動態を制御する際の基質候補も絞られて来ており、今後はAkt1が微小管動態を制御する分子メカニズムについても解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成29年11月に研究代表者の異動があり、一時実験を中断しなくてはならなかったため、当初の計画より遅れが生じてしまった。
また、本課題においては、Akt1による微小管動態制御メカニズムを明らかにするため、微小管可視化プローブの１つであるEMTB-GFPを用いてライブイメージングを行っていたが、新たに別の微小管可視化プローブ（tubulin-GFP）や微小管のプラス端に結合するEB1の可視化プローブ（EB1-GFP）が使用可能となり、これらのプローブを用いたライブイメージングの実験を追加で行うことにしたため、当初の予定より実験期間が長くなってしまった。
現在はこれらのプローブを用いて非常に高い解像度で微小管動態を観察出来るようになっており、今後は、Akt1ノックダウン細胞の微小管動態について詳細に観察する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
微小管可視化プローブ（EMTB-GFPおよびtubulin-GFP）、および微小管プラス端に結合するEB1の可視化プローブ（EB1-GFP）発現細胞をライブイメージングすることで微小管動態制御を詳しく解析し、微小管動態制御におけるAkt1の役割について明らかにする。さらに、Akt1を局所的に活性化する系を用いて、Akt1の活性を操作した時の微小管動態および細胞極性の変化を観察する予定である。Akt1を局所的に活性化する系としてCRY2とCIB1の二量体化を青色光の照射依存的に引き起こす手法を用いるため、この系を用いる場合にはGFPの蛍光観察を同時に行うことは出来ない。そこで、EMTB-mCherry、tubulin-mCherryあるいはEB1-mCherryなどの微小管やEB1を赤色蛍光でラベルするプローブを作製して用いる予定である。また、Akt1の基質候補分子EB2についてもその機能解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
研究期間中に研究代表者の異動があり、一時実験を中断しなくてはならなかったため、研究を当初の計画通りに進めることが出来なかった。また、新たな微小管可視化ツールを用いて追加実験を行うことにしたため、当初の予定より実験期間が長くなってしまった。
今後は、微小管可視化プローブ（EMTB-GFPおよびtubulin-GFP）およびEB1可視化プローブ（EB1-GFP）を高解像度で観察することにより、微小管動態制御におけるAkt1の役割を明らかにする予定である。また、Akt1を局所的に活性化した時の微小管動態についての解析、Akt1の基質分子候補であるEB2/RP1の機能解析も行う予定である。次年度使用額については、以上の実験を遂行するのに必要な消耗品、設備、備品の購入費用として使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
