細胞周期進行促進因子Cdc25Bの安定化に関わるPPaseの解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06993
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 山下 克美 金沢大学, 薬学系, 准教授 (10191280)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: プロテインホスファターセ / Cdc25A / Cdc25B

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、細胞周期進行制御のキー遺伝子であるCdc25AとCdc25Bに不安定化を誘発するキナーゼに拮抗し、脱リン酸化によりCdc25A/Cdc25Bを安定化させるプロテインホスファターゼ（PPase）を同定することを目的として開始した。
昨年度の研究により、代表的なオカダ酸感受性PPaseである、PP1とPP2AがCdc25A/Cdc25Bの安定化に関与しないかもしれないことが推定された。そこで今年度は、Cdc25A/Cdc25Bが多くの腫瘍組織で発現亢進されているという先行研究の成果に基づき、腫瘍において発現亢進の報告がある唯一のPPaseであるPPM1D/Wip1ホスファターゼを、Cdc25A/Cdc25B安定化を誘導する有力なPPaseの1つとして解析した。
この研究のためにまず、テトラサイクリンの培地への添加によりPPM1Dホスファターゼを発現誘導できるTet/ONシステムを構築した。本誘導発現系の構築には、発現制御細胞の選択が容易であるレンチウイルスベクターシステムを利用した。その結果、野生型のPPM1Dならびにホスファーターゼ活性喪失型PPM1Dを誘導発現できる細胞株が複数得られた。機能的に正常なPPM1Dタンパクが誘導発現されることは、DNA損傷によりリン酸化を受けるチェックポイント制御タンパクが、野生型PPM1Dの発現により脱リン酸化されることにより確認された。
現在はこのシステムをもちいて、野生型PM1D発現によりCdc25A/Cdc25Bの安定性増加が認められるか否かについて解析中である。しかしながら、細胞中のCdc25A/Cdc25Bの発現量が極めて低いため、解析が困難であることが判明したため、現在はCdc25A/Cdc25Bの発現量の変動を鋭敏に検出できるシステムの構築が必要であることが判明した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度は、オカダ酸感受性プPPaseがCdc25A/Cdc25Bの安定性を誘導するという予備実験の結果に基づき、代表的なオカダ酸感受性であるPPaseのPPase1とPPase2Aの関与の可能性を検討しが、必ずしも可能性が高くないことを示唆するデータが得られた。そこで当初の作業仮説を変更し、文献的にCdc25A/Cdc25Bの安定性関与の可能性があるPPM1Dを検討することに研究計画を変更しため、新たな実験系構築を余儀なくされた。
すなわち、PPM1DはDNA損傷チェックポイント関連タンパクの脱リン酸化能があることから、一過性発現では本来の細胞機能に予期せぬ異常が生じることも予想され、それが原因でCdc25A/Cdc25B発現量変化の正確な測定が困難となる可能性がある。その可能性回避のために、発現量制御を可能にするTet/ON発現誘導系を採用したことから、新たなシステム構築のために発現ベクターの作製から開始し、細胞の選択まで行なう必要が生じた。結果的に本システムの構築に4ヶ月かかり、さらに得られた細胞株の検定のために2ヶ月間消費したことから、実質的な解析期間は6か月となった。
さらに、Cdc25A/Cdc25Bの発現量の解析過程で、現有の抗体が細胞中のCdc25A/Cdc25Bを正しく認識しているか疑問を生じる結果が得られた。そこで、Cdc25A/Cdc25Bに適当なタグをつけたタンパク質を細胞内で発現させることにより、微妙な発現量の変化を鋭敏に検定することを目的として、外来からタグ付Cdc25A/Cdc25Bを発現させることにした。現在は、そのベクター構築と平行して先に得られたPPM1D誘導発現系を解析中である。
以上のような、当初の研究計画では予期できなかった問題が生じているために、全体的には研究の遂行が遅れ気味であると自己評価している。

Strategy for Future Research Activity

来年度は最終年度にあたるため、Cdc25A/Cdc25B安定化に関わる可能性のあるPPaseの解明に、最低でも何らかの成果を得る必要がある。
現在構築中の新しいシステムは約2ヶ月程度で終了することを予定しており、その後はPPM1DのCdc25A/Cdc25B安定性の可能性を集中的に検定する予定である。
一方、初年度の研究では、PP2Aの制御サブユニットを細胞へ導入しCdc25A/Cdc25Bの発現量変化を測定した。この実験では、細胞内でPP2Aのホロ酵素が再構築できているか疑問がある。この問題の解決のために、本年度の後半からPPM1D発現細胞の検定・解析と平行して、ホロ酵素を3種のサブユニットの融合タンパクとして発現させるための準備を進めてきている。さらに、これらのPP2Aサブユニット融合ホロ酵素発現と同時に、タグ付のCdc25A/Cdc25Bの発現が可能なシステムを構築すべく、プラスミド等の作製を進めている。
これらの新しいシステムの構築により、種々の可能性を検討することが可能となることが予想される。その結果、Cdc25A/Cdc25Bの安定性誘導PPase候補を解明するという当初の目的を達成することが期待される。もし当初の計画通りに解明ができなかった場合にも、最低でも候補PPaseの手がかりや手がかりを得るための新しい検定系の構築が期待される。