2017 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of biosynthetic mechanism of cyclic tetrapyrrole: Construction and cyclization of hydroxymethylbilane
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15K07018
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
佐藤 秀明 久留米大学, 医学部, 准教授 (60271996)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東元 祐一郎 久留米大学, 医学部, 教授 (40352124)
杉島 正一 久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
原田 二朗 久留米大学, 医学部, 講師 (10373094)
塚口 舞 (古澤舞) 久留米大学, 医学部, 助教 (40624094) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ヘム生合成 / X線結晶構造解析 / 酵素反応 / ポルフィリン / テトラピロール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ポルフィリン生合成経路では，ヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)の合成する鎖状テトラピロールがウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ(UROS)により環化される。本研究ではHMBSによる4分子のポルホビリノーゲン(PBG)から1分子のヒドロキシメチルビラン(HMB)への縮合過程と，UROSによるHMBの環化過程について反応機構の解明を目指した。
前年度までにPBG類似体を1つ結合したHMBSのES1型複合体の構造解析に成功し，PBG類似体が補因子近傍に非共有結合して活性を阻害することを示した。これは活性部位への最初の基質結合のモデルとなる。最終年度にはHMBSの反応途中で生じる酵素-基質複合体の結晶構造解析を行った。補因子をもつヒトHMBSに数当量のPBGを加えてイオン交換カラムクロマトグラフィーを行うと，PBG添加前より保持時間の長いピークが複数現れた。その1つを分取して質量分析し，HMBSにPBGが2分子結合したES2複合体の形成を明らかにした。これを結晶化し，SPring-8の放射光を用いてX線回折データを収集した。構造解析の結果，ES2複合体では補因子の先に2分子のPBGが連結し，基質フリーの場合よりも補因子が活性部位の奥側へ移動して，その元の位置を2つのPBG分子が占めることが判明した。これらの構造はHMBSが単一の活性部位で多段階反応を進めることを示唆し，補因子またはピロール鎖末端近傍へのPBGの非共有結合と，脱アミノ反応による共有結合形成に伴うピロール単位の移動を繰り返して，縮合過程が進むと考えられる。
一方，HMB類似体のビリルビン等を用いて，HMBSのES4型複合体やUROS-基質類似体複合体の結晶構造解析も試みたが，各複合体の結晶が得られず構造解明には至らなかった。さらに両酵素間の相互作用をネイティブPAGE法で検討した。両酵素だけの場合やモノピロールのPBG等を加えた場合に新しい複合体のバンドは現れず，両酵素間の相互作用には鎖状テトラピロールの結合が必要と推察された。
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