2016 Fiscal Year Research-status Report
放射光真空紫外円二色性によるタンパク質の高次構造解析と生体分子間相互作用の研究
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15K07028
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
松尾 光一 広島大学, 放射光科学研究センター, 准教授 (40403620)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 放射光円二色性 / 真空紫外領域 / ミエリン塩基性蛋白質 / 生体膜相互作用 / 二次構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放射光を用いた真空紫外円二色性（SR-VUVCD）法は、水溶液中の蛋白質CDを真空紫外領域(190nm以下)まで観測できるため、従来のCD法と比べより詳細で新規な構造情報を得ることができる。またVUVCDは、生体膜存在下のような様々な溶媒環境下で測定できるため、X線結晶学やNMR法では困難な膜結合蛋白質の構造解析に有効である。そこで本年度は、VUVCD法を、神経細胞の軸索周辺に存在するミエリンの安定化に重要な膜結合蛋白質、ミエリン塩基性蛋白質(MBP)の構造研究に応用し、膜結合状態におけるMBP構造を明確にし，MBPと生体膜との相互作用機構について考察した。
VUVCD分光法を用いて，ミエリンを構成する5種類のリン脂質(phosphatidylcholine:PC, phosphatidylethanolamine:PE, phosphatidylserine:PS, phosphatidylinositol:PI, sphingomyelin:SM)生体膜存在下におけるMBPのVUVCDスペクトル測定から，MBPは天然変性蛋白質であり，PC, PE, SM生体膜存在下では構造変化せず，PSとPI生体膜存在下ではα-helix構造を形成することが分かった。VUVCDとニューラルネットワーク法の組み合わせ法から，アミノ酸配列上での二次構造の位置予測を行った結果，MBPはPSとPI存在下で6つのα-helix領域を形成し，その内5つの領域で正味電荷がプラスであることが分かった。PSとPI生体膜表面はマイナスに帯電しているため，MBPは静電的相互作用により両生体膜表面と結合しα-helix構造を形成することが示唆された。またこれらのα-helix領域は，生体膜の条件により両親媒性へリックスを形成することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①これまで構築してきたVUVCDによる蛋白質構造解析法を用いて、ミエリン膜の成分である5種のリン脂質膜と相互作用したMBPの二次構造含量・本数・配列を決定することができ、これまで未解明であった生体膜結合部位のMBP構造を明らかにすることができたため。また、得られた構造解析の結果から、MBPと生体膜との相互作用機構について新たな知見が得られ、次の研究課題の構築に貢献したため。
②研究実績の概要で示した、MBPの構造解析以外に、α1酸性糖蛋白質(AGP)のVUVCD実験を行うことができたことや、平成29年度で実施予定であったβ2-microglobulin(β2-m)断片ペプチドのpHに依存したアミロイド線維のコンフォメーションの違いも観測できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
①昨年度得られた実験結果を基に、VUVCD分散計とFlow型線二色性測定システムを用いて、様々な生体膜と結合したAGPやMBPの二次構造含量・本数・配列・配向の解析を引き続き行うと共に、これら蛋白質と生体膜との詳細な相互作用機構および構造と機能の関係を明らかにし，VUVCD分光を用いた蛋白質-生体膜相互作用系の構造解析法の確立を目指す。
②VUVCD法・分子動力学(MD)法・CD理論を用いて、β2m断片ペプチド(#21-31及び#21－29)のアミロイド線維の高次構造解析を行う。具体的には、MD法でシミュレートした断片ペプチド構造から，新規に構築したCD理論を用いてVUVCDスペクトル算出する。実測スペクトルとの比較から，水溶液中でのアミロイド線維のコンフォメーション（シート構造や側鎖構造の配向など）を詳細に解析する。これらの研究により、VUVCD分光法を用いた蛋白質-蛋白質相互作用系の構造解析法の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
VUVCD測定に必要な窓材などの消耗品が当初予定していたよりも少額になったこと。また、出席予定していた学会に日程が合わず欠席したこと。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度における学会や研究打ち合わせの旅費及び研究に必要な消耗品に使用する予定である。
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