2015 Fiscal Year Research-status Report
Importin-αの多機能性に着目したがんの遺伝子発現制御機構の解明
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15K07068
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| Research Institution | National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition |
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Principal Investigator |
宮本 洋一 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 細胞核輸送ダイナミクスプロジェクト, サブプロジェクトリーダー (10379084)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 核輸送 / Importin-α / NLS / 乳がん / 細胞亜型 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、核輸送因子Importin-αファミリー分子の多機能性に着目し、特にImportin-α1の発現上昇と核局在化が、乳がんの進展や悪性度、がん細胞特異的な遺伝子発現にどのように関与しているかを明らかにするものである。
Importin-α8 (KPNA7)は、本研究課題で着目しているImportin-α1とアミノ酸配列の相同性が高い分子として同定され、輸送担体Importin-β1 と相互作用することから、新規Importin-αサブタイプとして分類されていた。しかしながら、実際、Importin-α8が核局在化シグナル（NLS)受容体として機能するかは不明であった。我々は、大腸菌より精製したImportin-α8リコンビナントタンパク質が、SV40T抗原NLS基質を直接認識し、Importin-β1と3者複合体を形成して核輸送することをセミインタクト核輸送実験系を用いて明らかにした(Kimoto et al., BBA-MCR, 2015)。また、プロテオミクス解析により、Importin-α1とImportin-α8は異なる基質特異性を示すことを明らかにした。さらに、Importin-α1やImportin-α8は、サブタイプごとでヘテロ二量体を形成する活性があり、Importin-α8はこの活性が非常に強い分子であることを証明した(Kimoto et al., BBA-MCR, 2015; Miyamoto and Oka, Data Brief, 2016)。このヘテロ二量体形成活性は、核内での積み荷の積み下ろしに関与していることも示した(Miyamoto and Oka, Data Brief, 2016)。
Importin-α1に特異的に結合する分子をプロテオミクス解析した結果、新たにimportin β binding (IBB) domain 結合分子としてRetinoblastoma Binding Protein 4 (RBBP4)を同定した。RBBP4は、核内RanGTPと協調してImportin-αからImportin-β1 を解離させる反応に寄与し、古典的NLSをもつ核タンパク質の核内輸送効率を制御していることを明らかにした(Tsujii, J. Biol. Chem, 2015)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
異なる乳がん細胞亜型株(MCF7、SK-BR-3、MDA-MB-231)及び 正常乳腺上皮細胞株(MCF10A)について、Importin-α1を含む7種のヒトImportin-αサブタイプの発現状況をisobaric tagging for relative and absolute quantitation (iTRAQ)法により解析した。また、各サブタイプに対する特異的抗体を用いたウエスタンブロットも並行して行った（本研究では、新たに抗Importin-α6 (KPNA5)抗体、抗Importin-α8 (KPNA7)抗体を作製した）。この結果、各サブタイプは亜型株ごとで発現に違いがあることが分かった。さらに、Importin-βファミリー分子、RanとRan調節因子、核膜孔構成因子、RBBP4など核輸送調節因子についても、乳がん細胞亜型株ごとでのタンパク質発現プロファイルを作製した。これらの解析結果を受け、乳がん組織を対象としたImportin-α1タンパク質の定量解析、免疫組織化学解析、クロマチン結合領域解析、相互作用分子の探索を進めている状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Importin-α1を含む複数のサブタイプについて、乳がん組織試料を用いた免疫組織化学、Selected Reaction Monitoring (SRM)法による定量解析を行い、細胞株でみられたサブタイプごとでの発現の違いが、実際の組織試料を反映しているかを検討する。また、核内での機能を探索していく目的で、クロマチン免疫沈降(Chromatin Immunoprecipitation: ChIP)と次世代シーケンサーを組み合わせたChIP-Sequence (ChIP-Seq)を行う。実験には異なる乳がん細胞亜型株を用い、各亜型ごとでImportin-α1が結合するクロマチン領域にどのような違いがあるのか、その違いが細胞亜型の特性に寄与していないかを検討する。この解析には、他のサブタイプも含める。
さらに、Importin-α1の高発現と核局在化が乳がんの悪性度と関連するとの報告が多くされていることから、Importin-α1の発現や核移行活性、核局在を抑制・阻害するような低分子化合物・核酸の探索を行う。
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| Causes of Carryover |
本研究課題を進めていく過程で、Importin-αサブタイプの発現パターンが乳がん細胞亜型株ごとで異なることが明らかとなった。また、サブタイプの中にはImportin-α1同様、核局在を示すものが存在しており、これらサブタイプの発現と核局在が亜型の特性と関係している可能性を示唆する結果を得た。このため、Importin-α1以外のサブタイプも解析の対象に含め、Importin-α1と対比する形で研究を遂行していく計画とした。以上の事から、解析に必要な相当額を次年度に使用することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
Importin-α1を含む複数のImportin-αサブタイプについて、乳がん組織試料を対象としたSRM解析、及び乳がん細胞亜型株を対象としたChIP-seq解析を行い、細胞亜型ごとで個々のサブタイプの発現量と機能がどのように相関しているかを明らかにしていく。
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[Journal Article] Cell surface localization of importin α1/KPNA2 affects cancer cell proliferation by regulating FGF1 signalling2016
Author(s)
Yamada K., Miyamoto Y., Tsujii A., Moriyama T., Ikuno Y., Shiromizu T., Serada S., Fujimoto M., Tomonaga T., Naka T., Yoneda Y., Oka M.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 6
Pages: 231410
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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