2015 Fiscal Year Research-status Report
分裂期終期染色体上に存在するLamin A 相互作用因子の同定
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15K07161
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
廣瀬 富美子 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (60208882)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 核ラミナ / ラミンＡ / SUMO化 / 翻訳後修飾 / 分裂期終期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラミンAがSIMコンセンサス配列を持ち、このSIM配列にアミノ酸置換変異を導入するとM期におけるラミンAの脱リン酸化が遅延すること、それに続く核ラミナの構築が破たんすることを見出した。分裂期終期におけるSUMO-SIM相互作用を介したラミンAの相互作用因子の精製を目指し、タグ付きのラミンＡ、タグ付きのSUMO2を発現する細胞株および、これらの細胞の同調培養法を確立した。また、ライブセルイメージングにより分裂期のラミンＡの動態を観察するために、GFP-ラミンＡ、CFP-SUMO2の発現系も作成した。予備的な結果ではあるものの、ライブイメージングおよびFRET法による両者の相互作用を観察することができた。
さらに、ラミンAのSIMとSUMO-SIM相互作用を起こすSUMO化タンパク質の候補を絞り込み、分裂期の終盤に起こるヒストンH3の脱リン酸化に関与するRepoMan-Phosphatase 1γ複合体がこの時期にラミンＡと相互作用することを示唆する予備的な実験結果を得た。具体的には、RepoManがSUMO化修飾を受けること、またSUMO化修飾を受けない変異型RepoManを細胞で発現させると、ラミンＡの脱リン酸化や核ラミナの形成が遅延することを観察した。このことからSUMO化されたRepoMan/PP1γとラミンAがSUMO-SIM相互作用により複合体を形成し、分裂期終了時におけるラミンAの脱リン酸化を制御するのではないかと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度に予定していた研究計画については概ね、順調に進んでいる。ただし、ラミンＡが染色体上に集まるのはわずか10分程度であることが、ライブセルイメージングの結果、判明した。このことは、タンパク質の精製が可能なくらいの量のこの時期の細胞を集めることが容易ではないことを意味する。したがって、今後はさらに精度のよい細胞周期の同調法と因子の精製法を工夫する必要があると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内でのラミンＡとRepoManの相互作用を時空間的に解析するため、ラミンA、RepoMan、SUMO2それぞれに別々の蛍光タンパク質を融合し、生細胞で共発現させ、三者の局在の変化を時間経過と共に観察するとともに、FRETを用いて詳細なこれらの相互作用について解析を進める。同時に生化学的な手法によりラミンＡとRepoManの相互作用がSUMO-SIM依存的に起こるのかどうかを証明する予定である。さらに、細胞内のRepoManをノックダウンが分裂期のラミンＡの動態や核ラミナの構築にどのような影響を与えるかを調べる予定である。
また、生化学的な手法を用いて分裂期細胞の抽出液からラミンAと相互作用するRepoMan 以外の因子の精製とその同定を進める。
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| Causes of Carryover |
2月の時点で論文が受理された。掲載料が20万円程度の予定である。3月末までに支払いがあると予想し、そのために使用しないで残したが、請求書が未だ届かず次年度払いにすることになった。さらに、これとは別に投稿中で修正中の論文があり、この論文の掲載料の支払いがある可能性があるため、合計で40万円を超える助成金を次年度に使用することになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
原著論文2報 (1報は受理、もう1報は審査中）の掲載料として使用する。
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Research Products
(6 results)
