2016 Fiscal Year Research-status Report
グラム陽性細菌の定常期の生理状態を制御する分子機構の細胞死誘発物質を用いた解析
| Project/Area Number |
15K07350
|
|---|
| Research Institution | Saitama University |
|---|
Principal Investigator |
朝井 計 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (70283934)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 細胞死 / 細胞壁溶解 / DNA損傷 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細菌の、対数増殖とは異なる、定常期の細胞増殖や細胞死に関しては、大腸菌等のグラム陰性菌を中心とした先行研究により、その生理現象や関与する分子機構がわかってきている。一方、グラム陽性菌では、関連の研究は全くされていなかった。そこで、グラム陽性細菌の代表である枯草菌についての解析で、SigIシグマ因子の破壊株が定常期増殖を維持できず細胞死すること、植物親油性香気成分が定常期の枯草菌細胞特異的に細胞死を誘発することを端緒とした、グラム陰性菌とは異なるグラム陽性菌の細胞死を制御する分子機構の解明を目的とした。
成果１）SigIの定常期における機能を解析することで、グラム陽性細菌の定常期の生理状態を制御する分子機構の解明を目指した。その結果、SigIが転写の開始を制御する複数の遺伝子を新たに同定し確認した。それらの遺伝子は細菌の最外層をなす細胞壁の合成・修復を担う遺伝子と、DNA合成に関わる補助因子であったことから、定常期においても細胞は様々なストレスによる細胞内外の損傷を受けており、この修復にSigIが関与していることが示唆された。
成果２）植物親油性香気成分の抗菌作用と比較するために、添加物として使用されている抗細菌活性を有する化合物の枯草菌に対する作用機序の解析を行ったところ、化合物の構造はそれぞれ大きく異なるが、同様の活性を有することが示唆された。また、植物親油性香気成分に対して感受性となる枯草菌株から、耐性が復帰した抑圧変異を取得し解析したところ、DNA修復に関わるDNA分解酵素であると報告のある因子であった。この因子によって抗菌作用が緩和された理由、原因については、現在解析中であるが、成果１におけるSigIの関与する定常期のDNA損傷ストレス応答機構との関連において興味深い知見である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は以下の研究計画に基づいて実施する予定としていた。１）SigIによって制御される遺伝子の同定；枯草菌ゲノム上の全遺伝子を対象とした網羅的な制御遺伝子の確認・同定をめざし、株構築を行い、構築された株に導入した人為的変異が機能に与える影響を調べる段階に時間を要した。現在、網羅的解析に習熟した研究者との共同研究を予定している。一方で、少数ではあるが、新たなSigI制御遺伝子の同定に成功した。２）SigIシグマ因子制御系のシグナルの解明；SigIシグマ因子は、環境の変化や細胞表層の状態により細胞表層に局在する膜タンパク質を介してその転写因子としての機能が制御されていると考えられる。SigIの制御膜タンパク質に点変異や欠失変異を導入し、シグナル受容に必要な領域の決定を行う前に、同様の機構である程度知見のある別の膜タンパク質を用いたパイロット実験を行い、一定の成果を挙げることができている。３）植物由来親油性香気成分の細胞死誘発に関わる原因遺伝子の解析；枯草菌親株そのものからではないが、植物由来親油性香気成分への感受性が緩和される、サプレッサー変異株の取得に成功した。次世代シーケンサーよる全ゲノム配列再決定により塩基変異の部位を同定し、実際にどの塩基変化がサプレス現象に関与しているかを実験的に決定することができた。４）植物由来親油性香気成分の添加による細胞への影響のオミクス解析；オミクス解析を行うためには、試験する成分の量が十分得られることが必要であった。しかし、成分を植物体から必要量抽出するには手間と時間を要するため、大規模なオミクス解析は困難であった。そこで、視点を変え、実際に製品に使用されている防腐剤の中で、植物由来親油性香気成分と同様の活性を有するものがないか検討した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
SigIが定常期において転写を制御する遺伝子を網羅的手法（GeF-seq）により解析する。その後得られた候補遺伝子が実際にSigIで制御されているかを遺伝学的、生化学的手法で確認する。
増殖するか細胞死を起こすかといった細胞の運命は細胞集団で一様ではなく、細胞で個別に誘発され決定されると考えられる。SigI自身やSigI制御遺伝子の定常期における転写発現GFP（緑色蛍光タンパク質）をレポーターとし、蛍光顕微鏡等で解析し、細胞集団の中のヘテロな遺伝子発現の挙動を観察する。その際、増殖に必須なSigAの活性を異なる波長をもつ蛍光タンパク質でモニターし、比較検討する。
SigIやSigI制御因子の中には、WalKRと呼ばれる別の転写制御系で制御されるものが多い。WalKRは増殖に必須で、増殖中の細胞維持に関与していることが知られている。そこで、WalKRとSigIは増殖期と定常期において機能分担しているのではないかとの仮説を新たに打ち立て、その観点からSigIの機能を再解析する。
植物由来親油性香気成分については天然由来のものを抽出して解析するための十分な量を得ることが難しいため、既知の防腐剤で同様の活性をもつものを利用して、枯草菌細胞に与える影響の詳細な分子機構の解明を試みる。既知の防腐剤には種々の誘導体も取得しているので、様々な官能基、置換基の影響を観察することができる。
植物由来親油性香気成分への感受性を回復させる変異がDNA修復因子の機能低下であったという知見については、未だその回復の理由が判明していないので、DNA修復因子という既知の機能にとらわれず、新たに枯草菌においてその機能を再解析する。
|
| Causes of Carryover |
当初予定していた、SigIが転写を制御する遺伝子群の網羅的解析を行う前にいくつかのパイロット実験を行なったため、大規模解析を実施しなかった。パイロット実験により、少数の候補遺伝子に対して、SigIが直接的に転写を制御しているかを確認し、大規模解析に用いる枯草菌株を作製したが、解析に用いる前に、その株の有効性を他の小規模実験により確認した。前述のように、SigIやSigIが制御する遺伝子の発現プロファイル解析に用いる適切なプロモーターの策定に時間を要したため。
植物由来香気成分の大規模な抽出実験を断念し、代わりに同様の活性を有する単純な構造の、既に防腐剤として使用されている化合物を代替として使用したため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
SigIが転写を制御する遺伝子群の網羅的解析（GeF-seq)のための、消耗品、試薬の購入及び実験の外注にかかる経費、研究員を利用するための謝金等に利用する。本研究で解析している植物由来香気成分の活性に該当する、他の天然物質のスクリーニングを行うための候補物質の入手費用とする。解析に供する多くの菌株の構築に必要な、DNAハンドリングのための試薬やキット、合成オリゴDNAの購入費用とする。時には公的機関に保存されている菌株等の購入費として使用する。
|
