2017 Fiscal Year Research-status Report
グラム陽性細菌の定常期の生理状態を制御する分子機構の細胞死誘発物質を用いた解析
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15K07350
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
朝井 計 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70283934)
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2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞死 / 転写開始制御 / 細胞膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌には対数増殖とは異なり、定常期に突入した後も、生理学的な意義においても独特な細胞増殖や細胞死を行っていることが、大腸菌を中心としたグラム陰性菌での解析により分子レベルで明らかになってきている。一方、グラム陽性菌では、関連の研究は全くされておらず、グラム陽性細菌の代表である枯草菌について、定常期増殖の解析を行い、グラム陰性菌とは異なるグラム陽性菌の細胞死を制御する分子機構の解明を目的とした。これまでに転写開始因子SigIシグマ因子が、定常期の細胞生存を制御していること、ある植物親油性香気成分が大腸菌ではなく、枯草菌を特異的に溶菌し、この作用は対数増殖期の細胞だけでなく、定常期の細胞にも及ぶことがわかっている。これらのことから、枯草菌の定常期の細胞も、対数増殖期とは異なる状態にあることが強く示唆された。
成果１）破壊により定常期に細胞死を誘発するSigIシグマ因子の機能を解析するために、SigIが転写の開始を制御する複数の遺伝子を新たに同定し、それらの遺伝子の転写開始に関与するプロモーターの役割を解析した。その結果既知のシグマ因子の認識するプロモーター配列とは異なる、新たな塩基配列が転写開始に関わっており、この配列がSigIによる定常期増殖制御に関与する可能性が示唆された。
成果２）精製入手が困難な植物親油性香気成分の恒常的、網羅的な解析が困難であったのと、その抗菌作用と比較するために、防腐剤として使用されている既存の化合物の枯草菌の増殖に対する影響の解析を行った。長鎖の脂肪酸を側鎖に含むこの化合物でも、植物親油性香気成分と同様の活性を有することが示唆された。この活性は側鎖の脂肪酸の炭素数や、脂肪酸と主鎖の結合様式で変化した。このことから、活性には、化合物と細胞膜との相互作用が関係していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当該年度は以下の研究計画に基づいて実施する予定としていた。１）SigIが定常期において転写を制御する遺伝子を網羅的手法（GeF-seq）により解析する。GeF-seqを行うためにSigIにヒスチジンタグを付加した株の構築を行い、SigIの機能に変化がないか確認したのち、GeF-seq解析に習熟した研究者に解析を依頼した。しかし、依頼先の研究者が所属する研究機関を変えたため、研究環境が変わり、すぐに解析に対応できなくなってしまった。２）定常期に増殖するか細胞死するかは細胞集団で個別に誘発され決定されると考えられる。SigI自身やSigI制御遺伝子の定常期における個々の細胞での発現様式を、GFP（緑色蛍光タンパク質）をレポーターとし、フローサイトメトリーにより解析する。研究代表者も研究機関が変わり、新所属先にはフローサイトメーター装置があるが、使用手順や使用規定の習熟に時間を要した。３）植物由来親油性香気成分が枯草菌細胞の細胞死を誘発する分子機構を解析するために、植物由来親油性香気成分への感受性が緩和される、サプレッサー変異株の取得を行い、いくつかの工夫を経て、その取得に成功し、全ゲノム配列再決定により塩基変異部位の同定に至っている。しかし、感受性が緩和される耐性株の取得は困難で、この性質は抗生物質としては優良だが、遺伝学的手法で解析するうえでの、大きな障壁となっている。
総じて最も大きな事由は、研究代表者の異動により、所属する研究機関が変更になったことである。異動先の研究環境は異動前とほぼ同様あるが、研究に使用していた機器、実験器具や薬品の移動、移設および、それらの立ち上げに時間を費やした。また、異動前の機関で研究協力者として実験の補助を行っていた学部学生や大学院生も卒業等で離散したため、異動後の機関で学部学生の養成を行った。従って現在までの達成度の区分を（３）とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）SigIによって制御される遺伝子の同定を網羅的に行う予定である。網羅的解析に最も有効なGeF-seq解析を依頼した研究者次第ではあるが、仮に実施されなくても、すでにSigIで制御される多数の遺伝子を同定し、SigIが認識するプロモーターの塩基配列も判明している。これらの配列データーをもとに、枯草菌ゲノム塩基配列を検索し、SigIにより制御される遺伝子候補を探索することも可能である。既に研究代表者が明らかにしたSigIの認識する塩基配列は、これまで知られたシグマ因子の認識する配列、部位とはことなるプロモーター領域にあり、この新たな制御領域が、SigIが枯草菌の定常期での生存を司る機構とどのように関係しているのか、解析する。
２）SigIやSigI制御因子の中には、WalKRと呼ばれる別の転写制御系で制御されるものが多い。WalKRは増殖に必須な二成分転写制御系で、増殖中に、細胞壁や細胞分裂を含め細胞維持に関与していることが知られている。すなわち、WalKRとSigIは制御する遺伝子を共有しつつ、増殖期と定常期において機能分担しているのではないかと考えられる。この仮説を証明するために、両者の関係について遺伝学的手法を用い、それぞれの破壊、変異、過剰発現が相互に与える影響を解析する。
３）植物由来親油性香気成分への感受性を回復させる変異がDNA修復因子の機能低下であったが、未だその回復の理由が判明していない。それらの遺伝子のDNA修復因子という機能は他の細菌種での解析であり、またDNA修復においてもその詳細な機能は不明である。そこで、DNA修復因子という既知の機能にとらわれず、それらの遺伝子の変異株、破壊株を作製し、新たに枯草菌においてその機能を再解析する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
SigIが転写を制御する遺伝子群の網羅的解析により見出される遺伝子群は多数であることが予想され、その解析に、遺伝子破壊や遺伝子発現解析等多くの予算が消費される予定であった。しかし、網羅的解析の実施の遅れが生じたため、パイロット実験により、比較的少数の候補遺伝子に対して、SigIが直接的に転写を制御しているかを確認した。その代わりに、SigIの制御に必要な新奇の標的DNA配列を見出すに至り、この解析に重点を置いた。植物由来香気成分の枯草菌細胞に与える影響に関しては、破壊すると感受性となる遺伝子や、成分の溶菌活性に耐性となる遺伝子を見出したが、その後の解析の実施が困難であった。代わりに同様の活性を有する単純な構造の、既に防腐剤として使用されている化合物を代替として使用したため、植物由来香気成分の抽出精製に使用する額が軽減された。
（使用計画）
SigIが転写を制御する遺伝子群の網羅的解析のための、消耗品、試薬の購入及び実験依頼にかかる経費、謝金等に利用する。植物由来香気成分の活性を有する物質のスクリーニングを行うための候補物質の入手費用とする。解析に供する多くの菌株の構築に必要な、試薬やキット、合成オリゴDNAの購入費用とする。公的機関に保存されている菌株等の購入費として使用する。また最終的には、それらの解析結果の学会や研究会における発表と、論文作成を行う費用にあてる。
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