2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K07388
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
保川 清 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (30397559)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
兒島 憲二 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (40542759)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 逆転写酵素 / MMLV RT / RNase H / 耐熱化機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵素（RT）は分子量75,000のモノマーで、5個のドメイン（Fingers、Palm、Thumb、Connection、RNase H）から成り、DNAポリメラーゼ活性とRNase H活性をもつ。両活性の活性部位はそれぞれPalmおよびRNase Hドメインに存在する。我々は大腸菌を宿主として、部位特異的変異導入により耐熱性が向上したMMLV RTを作製した。しかし、それらの耐熱化機構は不明な点が多い。本課題は、結晶構造解析と酵素化学的解析により、耐熱型MMLV RTの耐熱化機構を解明することを目的としている。
平成27年度は、MMLV RTのRNase Hドメイン（I498－L671）を調製し、性状解析を行った。完全長のもの（WT）および基質結合部位を含むI593－L603あるいはG595－T605が欠失したもの（それぞれΔC1、ΔC2）に、Strep-tag（WSHPQFEK）と(His)10をそれぞれNおよびC末端に付加させたものを大腸菌で発現させ、菌体から精製した。蛍光基質を用いたRNase H活性の測定では、WTは活性を示したが、ΔC1とΔC2は活性を示さなかった。蛍光増加量から、RNase Hドメイン単独の活性はMMLV RTのそれよりも著しく低いことが示された。放射性基質を用いたRNase H活性の測定の結果、WT、ΔC1およびΔC2では鎖長が異なる7－16 塩基のバンドが同程度の強度で検出された。これは、本基質にMMLV RTを作用させたとき、14－20塩基のバンドが強く検出されたことと異なった。またΔC1とΔC2は活性を有したが、WTよりも著しく低かった。単独発現させたRNase H 領域はDNA合成活性の活性部位をもたないために、基質との親和性が低く、切断部位が不特定になったと考えられる。現在、これらの結晶構造解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成27年度の当初計画は「１．RNase H領域の生産」、「２．RNase H領域単独および鋳型プライマー（T/P）との複合体の結晶構造解析」、「３．RNase H領域の活性測定」であった。このうち、１と３については十分達成され、学会発表および論文発表を行った。一方、２についてはよい結晶が作製されなかった。現在、精製条件や結晶作製条件をいろいろと変えて取り組んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度未達課題である「RNase H領域単独および鋳型プライマー（T/P）との複合体の結晶構造解析」に集中して取り組む。これが達成されれば、当初の計画に基づき、「野生型酵素（全領域を含む全長酵素）の生産」、「WT単独およびT/Pとの複合体の結晶構造解析」、「WTと変異体（いずれも全領域を含む全長酵素）の活性測定」に取り組む。
本課題の研究分担者である兒島憲二助教は当初の計画どおり、平成27年4月1日から平成28年3月31日まで米国NIHのDr. Robert Crouchの研究室に滞在し、酵母のRNase H2に酵素化学的解析を行った。兒島は、平成28年は、NIHで学んだ技術をもとに、ヒトRNase H2の酵素化学的解析に取り組む。
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Preparation and characterization of the RNase H domain of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase2015
Author(s)
Nishimura, K., Yokokawa, K., Hisayoshi, T., Fukatsu, K., Kuze, I., Konishi, A., Mikami, B., Kojima, K., and Yasukawa, K.
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Journal Title
Protein Expression and Purification
Volume: 113
Pages: 44, 50
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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