2015 Fiscal Year Research-status Report
キノン補酵素形成に関与する新規トリプトファン水酸化酵素の精密反応解析
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15K07391
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中井 忠志 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (00333344)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | モノオキシゲナーゼ / FAD / X線結晶構造解析 / 分子内架橋 / チオエーテル結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素（QHNDH）の生合成を制御するオペロンは、酵素サブユニット以外にもFAD 含有モノオキシゲナーゼをコードするqhpG 遺伝子を含んでいる。QhpG タンパク質は、QHNDH の低分子量γサブユニットにおいて、Trp 残基側鎖インドール環を特異的に水酸化し、キノン補酵素形成の初発反応を引き起こすと考えられている。その反応機構を解明することが本研究の目的である。これまでに先行実験において判明したPseudomonas putida由来QhpGの結晶化条件をさらに最適化し、安定的に結晶を得る条件を見出した。新たに調製した結晶を用いてX線回折データを収集した結果、これまでの2.7 オングストロームに比較して、2.5 オングストロームまで分解能を改善することに成功した。位相決定のために、NaBr、PbCl2などの重原子試薬でソーキングし、重原子同型置換法、SAD及びMAD法による解析を行い、まだ不十分ではあるが解を得ている。また、試験管内反応系の構築のために、シトクロムb5 還元酵素、NADH、およびフェノサフラニンなどの電子伝達色素を加え、還元された色素を介して、大気条件下でもPpuQhpG のFAD が連続的に還元されるようにする系の構築に成功した。本系にペプチド基質を加え、生成物を質量分析した結果、水酸化されたペプチドは得られていないが、ジスルフィド結合ではない何らかの共有結合で架橋された生成物の形成を見出した。さらに、P. putidaの架橋された全長QhpC、すなわち生理的条件下における基質を調製するため、QhpD/QhpCの共発現系の構築にも成功した。引き続き、QhpGと全長QhpCとの反応も解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
反応系構築ならびに反応機構を解析するための生成物分析に関しては、想定以上に進展している。X線結晶構造解析については、分解能の改善、重原子標識結晶の調製に加え、まだ不十分ではあるが位相の決定にも成功しているなど、ほぼ想定通りの進展があった。
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| Strategy for Future Research Activity |
当面、X線結晶解析によるQhpGの構造決定の早期の完結を第一の目標とする。その上で、予定通りに速度論的解析にもとづく詳細な反応機構の解明を行う。
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| Causes of Carryover |
結晶化条件の最適化が順調に進展し、想定していたよりも物品費の使用金額が減額されたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
より一層、研究を進展させるべく、X線結晶解析データ収集のための出張日数を増やす予定である。
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