2016 Fiscal Year Research-status Report
キノン補酵素形成に関与する新規トリプトファン水酸化酵素の精密反応解析
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15K07391
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中井 忠志 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (00333344)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | オキシゲナーゼ / FAD / X線結晶構造解析 / 分子内架橋 / チオエーテル架橋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素（QHNDH）の小サブユニットQhpC上の補酵素生合成に関与するQhpGに関して、構造決定と生化学的な機能解明を進めている。これまでに、アミノ酸配列情報に基づいて、QhpGはFAD結合蛋白質であり、オキシゲナーゼであることが予測されているが、その詳細は全く解明されていなかった。今期の研究成果として、QhpG結晶を水銀化合物でソーキングすることによって、重原子誘導体結晶の調製に成功した。これはパターソンマップ上の明確な異常分散ピークによって明らかとなった。現在、単一重原子同形置換法（SIRAS 法： Single isomorphous replacement plusanomalous scattering）による位相決定を進めている。生化学的な解析では、QhpGが触媒する反応の解析において大きな進展があった。まず基質となる３つのチオエーテル架橋を含有するQhpCの安定的な調製に成功した。MALDI TOF MS測定機によって、QhpCのAsp-N消化産物をMS/MS解析した。その結果、架橋が存在すると、開裂による断片化が起こらないため、架橋領域を明確に同定することができた。さらに、Native電気泳動の結果、架橋形成酵素QhpD, QhpG、およびQhpCは安定な３者複合体を形成することがわかった。この相互作用情報に基づいて、各種の反応条件を検討したところ、架橋形成酵素QhpD存在下、還元的環境下において分子状酸素を添加すると、QhpGによるQhpCの水酸化反応が起きることを見出した。これは、反応産物のAsp-N消化物を質量分析すると、補酵素前駆体Trp残基を含むQhpC架橋断片が質量増加することによって判明した。すなわち、QhpGはQhpC/QhpDの３者複合体となることによって、オキシゲナーゼとして機能発現することがわかった。QhpDは、QhpGの反応の足場としても機能すると推測される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
QhpGのX線結晶構造の決定に向けて、着実な進展があった。また、QhpG反応系の構築ならびに反応物同定の手法を確立することができ、QhpG反応機構の解析に向けて有益な情報が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
位相決定とモデリングを進めて、早急にQhpGの立体構造を決定する。また、QhpGの反応解析を進める分光学的な手法についても検討する。構築された反応系によって、ペプチド断片のTrpを水酸化できるかどうか解析し、想定通りの反応が起きた場合には、変異型酵素の解析などを行い、QhpGの詳細な触媒機構解明を行う。加えて、QhpGを用いたペプトド環状化の方法の開発に関しても、研究をすすめる。
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| Causes of Carryover |
原著論文の投稿費用として確保してあったが、より確定的な結果を得るために最終的に次年度に論文発表を繰越すことになったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
原著論文の発表を含めて、成果の発表を急ぐとともに、適正な予算使用を進める。
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