2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K07464
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| Research Institution | Aomori Prefectural Industrial Technology Research Center |
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Principal Investigator |
内沢 秀光 地方独立行政法人青森県産業技術センター, 弘前地域研究所, 室長 (10505572)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
工藤 謙一 地方独立行政法人青森県産業技術センター, 八戸地域研究所, 所長 (90250232)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | シジミ / 冷凍 / アコルビン / オルニチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シジミを冷凍すると得られたエキスに含まれるOrnとβ-Alaが増加する。そのメカニズムを検討した結果、研究代表者らが発見したトリペプチド（アコルビン、β-Ala-Orn-Orn）が分解されることが要因であることを明らかにした。また、シジミを5℃以上の温度に戻すと、逆にOrnとβ-Alaからアコルビンが合成されることも分かった。しかし、なぜそのような現象が起こるのか、制御機構やアコルビンの役割等については全く分かっていない。本研究は、シジミの冷凍におけるアコルビンを介した応答の生理的意味を解明することで、新たな冷凍技術を開発することを目的として研究を進めている。アコルビン合成酵素について、機能的に関連すると考えられるカルノシン合成酵素遺伝子を選定し、アミノ酸配列の類似性が比較的高い4領域を選びプライマーを設計し、シジミ可食部から抽出したDNAを用いて、プライマーの組合せやアニーリング温度などのPCR増幅条件を検討した。その結果、複数のバンドが検出され解析を進めている。また、シジミからアコルビン合成酵素の精製を試みた。十三湖産ヤマトシジミから足を採集し、リン酸カリウム緩衝液を加えてポリトロン処理した後、遠心分離により得られた上清をDEAE-Sephacelイオン交換クロマトグラフィーに供し、NaCl濃度により溶出した。その結果、0.32M NaCl濃度にアコルビン合成酵素活性がみられた。また、アコルビン合成にはATP及びMg2+が必須であることが分かった。さらに、酵素におけるアコルビン合成過程において、β-Ala-Orn及びOrn-Ornが生成されるかを調べた結果、これらはほとんど検出されないことから、β-Ala-OrnあるいはOrn-Ornを経ずにβ-Ala-Orn-Ornが合成されると考えられた。またこの結果から、反応に関与している酵素は1種類である可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アコルビン合成酵素の精製が進み、Orn及びβ-Alaを基質としたアコルビンの合成反応において、β-Ala-OrnあるいはOrn-Ornの中間物質を経ずに一気にβ-Ala-Orn-Ornが合成されることが分かり、また関与する酵素が1種類である可能性が示唆されたことは、酵素反応のメカニズムを解明する上で有意義な情報が得られたと考えている。またクローニングについては、これまでに知られていない酵素であることから、当初から難易度が高いと想定されたが、機能的に関連するカルノシン合成酵素に着目して遺伝子情報を解析し、プライマーを設計して種々増幅条件を検討した結果、シジミ可食部から抽出したDNAを用いたPCR増幅で複数のバンドが検出され、解析を進めている。以上のことから、おおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
アコルビン合成酵素について、ゲルろ過クロマトグラフィー等を用いてさらに精製を進め、電気泳動に供すると共に、基質特異性や至適pH等の酵素特性を明らかにする。また、PCR増幅で検出された複数の断片の塩基配列を決定し、既知のカルノシン合成酵素遺伝子と遺伝子配列を比較し、アコルビン合成酵素遺伝子のクローニングを進める。
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