加熱時の異常軟化を誘発するマナマコ体壁の生息環境依存的生理異常の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07584
• Research Institution: Fukui Prefectural University
• Principal Investigator: 水田 尚志 福井県立大学, 海洋生物資源学部, 教授 (30254246)
• Project Period (FY): 2015-10-21 – 2018-03-31
• Keywords: ナマコ / 体壁 / 加熱 / 脆弱化 / 生理異常 / コラーゲン / 結合組織

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までの研究結果から、正常個体と軟化個体とでは真皮の熱収縮の度合いに違いがあることが示唆された。ニセクロナマコ（Holothuria leucospilota)に関する既往の研究では、生きた真皮組織のコラーゲン繊維間相互作用に関わる主要因子としてH-テンシリン（34kDa）やソフテニン（20kDa）が報告されている。今年度においては、マナマコにおける相当タンパク質も視野に入れながら、主にタンパク質成分の質的・量的な違いに焦点を当てて研究を行った。試料については４月に予備実験用試料を託送により得るとともに、６月には現地（利尻島）へ出張してサンプリングを行った。軟化個体の識別に関して、今回は正中線に沿って左右に体を分断し左側をボイルすることで、ボイル試料と組織学的に等価の生鮮試料（右側）を得るなど実験上の工夫を行った。ボイル歩留りに関しては昨年までの結果と同様に軟化個体で高くなる傾向を示した。それぞれ５個体の正常個体と軟化個体について、その生鮮試料に対して2倍量の抽出液（2M NaCl、10mＭ EGTAならびにプロテアーゼインヒビターカクテルを含む20mMトリス-塩酸緩衝液、pH8.0)を加えてホモジナイズした。なお、本抽出により非コラーゲン性タンパク質のほとんどが抽出される。得られた上清画分をSDS-PAGEに供した結果、３つのタンパク質成分（200、45および31kDa）において試料間で量的な差異が認められ、軟化個体は正常個体に比べて45kDa成分に乏しく、200および31kDa成分に富む傾向が認められた。200kDa成分は既報の400kDa糖タンパク質を構成するサブユニット成分であるが、45kDaや31kDa成分は未知成分である。今後、これら未知成分の同定を進めつつ、量的に差が見られた3成分が真皮の熱収縮にどのように関わっているかについて検討を進める。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

正常個体と軟化個体の生鮮試料について、これまで行った一般成分ならびにコラーゲンに関する分析では全く差異が検出されなかったが、今回行ったナマコ真皮抽出画分のSDS-PAGEにおいてパターンの差異が示され、軟化個体は正常個体に比べて45kDa成分に乏しく、200および31kDa成分に富む傾向が認められた。このように、異常脆弱化が発生するメカニズムを解明する上での手がかりの一つとなる知見が得られたため。

Strategy for Future Research Activity

生鮮試料のSDS-PAGE分析において、上述したように軟化個体は正常個体に比べて45kDa成分に乏しく、200および31kDa成分に富む傾向が認められた。200kDa成分は既報の400kDa糖タンパク質を構成するサブユニット成分であることが分かっている。400kDa糖タンパク質は非コラーゲンタンパク質としては最も真皮内に豊富に存在し、そのほとんどが組織内液中に溶存しているが、軟化個体で量的に多いことから、これがコラーゲン繊維の熱収縮を阻害している可能性がある。本タンパク質の含有量の違いを比色定量法などによりより明確に示すとともに、モデル実験系を構築してコラーゲン繊維の熱収縮に対する本タンパク質の影響を解析する。また、45kDaや31kDa成分は未知成分であるため、それぞれ精製を行った上でN末端配列解析等により同定・性状解析を進めることによりニセクロナマコで報告されているH-テンシリンやソフテニンとの関連性を調べる。

Causes of Carryover

本研究では研究の再現性を考慮し、特別の事情がない限りは使用するナマコ試料を北海道利尻島海域で漁獲されるものに限定している。北海道利尻島ではナマコの漁期が年2回（4月および6月）のみであることに加え、本研究の採択日が平成27年10月21日で研究初年度（平成27年度）における研究開始時点で既に漁期が終了していたことから、本研究の実質的な開始が平成28年度となった。よって、平成28年度においては主に平成27年度の未使用額を使用して研究を進めることとなったので、「次年度使用額」（971,319円）が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成29年度においては新たに6月に試料採取を行う予定であり、「次年度使用額」はこの試料採取ならびにこれを用いた実験にかかる費用として用いる予定である。