2016 Fiscal Year Research-status Report
独自システムによるホモKOマイクロミニブタ細胞の効率的濃縮とその応用
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15K07695
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三好 和睦 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 教授 (70363611)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マイクロミニブタ / 胎仔性繊維芽細胞 / CRISPR/Cas9 / ゲノム編集 / targeted toxin / LDLR / 動脈硬化 / 体細胞核移植 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、最近開発された次世代型KOと呼ばれるCRISPR/Cas9などのゲノム編集技術を用いてブタ（マイクロミニブタ）胎仔由来の繊維芽細胞（MPEF）ゲノム内の特定遺伝子（異種移植関連遺伝子alpha-1,3-galactosyltransferase [alpha-GalT]や動脈硬化責任遺伝子low density lipoprotein receptor [LDLR]）を完全に破壊し、我々がこれまでに独自に開発したKO細胞のみを効率的に濃縮する系（targeted toxin-based selection）を用いて遺伝子改変MPEF株を作製し、最終的にその細胞をドナーとする体細胞核移植によるクローン個体作製、それによる動脈硬化モデルブタ作製を試みる。平成２8年度では遺伝子改変MPEF株の特性解析、それを用いた体細胞核移植による胚盤胞作成を行った。その結果、alpha-GalT, LDLR遺伝子のKOを行い、得られた株の～30%はdouble ホモKO、～60%はalpha-GalTホモKO/LDLRヘテロKOであった。組織化学染色、抗体を用いた免疫染色からdouble ホモKOではalpha-GalT, LDLRの蛋白発現は皆無であった。これをドナーとする核移植由来の胚盤胞でも両者の蛋白発現は皆無であった。また、当該胚の分子生物学的検討から、両遺伝子の変異が確認された。以上から、今回得られたalpha-GalT, LDLR遺伝子をダブルにKOされた細胞は、体細胞核移植経由によるクローン個体作製に十分供試できることが判明した。今後、この細胞を用い、本格的にalpha-GalT, LDLR蛋白発現が欠失したブタ個体を作成する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
alpha-GalT, LDLR遺伝子のKOを行い、得られた株の~30%はdouble ホモKO、~60%はalpha-GalTホモKO/LDLRヘテロKOという良好な成績を得た。また、組織化学染色、抗体を用いた免疫染色からdouble ホモKOではalpha-GalT, LDLRの蛋白発現は皆無であった。これをドナーとする核移植由来の胚盤胞でも両者の蛋白発現は皆無であった。また、当該胚の分子生物学的検討から、両遺伝子の変異が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29度では、平成28度に得られたdouble ホモKO MPEF株をドナーとする体細胞核移植を行い、移植胚のレシピエントメスブタ（マイクロミニブタ）への移植によるクローンブタ個体作製を行う。
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Research Products
(18 results)
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[Journal Article] The piggyBac-based gene delivery system can confer successful production of cloned porcine blastocysts with multigene constructs.2016
Author(s)
Sato M, Maeda K, Koriyama M, Inada E, Saitoh I, Miura H, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S, Miyoshi K
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Journal Title
International Journal of Molecular Sciences
Volume: 17
Pages: 1424
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] The genetic engineering-based isolation of lymphoid enhancer-binding factor-1 (LEF1) positive stem-like cells from human deciduous tooth cell-derived iPSCs.2016
Author(s)
Murakami T, Saitoh I, Sato M, Inada E, Soda M, Iwase Y, Sawami T, Suzuki A, Ohshima H, Hayasaki H
Organizer
10th Biennial conference of the pediatric dentistry association of Asia in conjunction with 54th annual conference of the Japanese society of pediatric dentistry
Place of Presentation
Tokyo Dome Hotel (Tokyo, Japan)
Year and Date
2016-05-26 – 2016-05-28
Int'l Joint Research
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