2015 Fiscal Year Research-status Report

新規標的タンパク質の構造解析に基づく新たな抗結核薬の創製

Research Project

Project/Area Number	15K07909
Research Institution	Mukogawa Women's University
Principal Investigator	山下沢武庫川女子大学, 薬学部, 准教授 (70398246)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宇野公之大阪大学, 薬学研究科, 教授 (00183020)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	結核菌 / 抗結核薬 / 結晶構造解析 / ドッキングシミュレーション / 創薬
Outline of Annual Research Achievements	海綿由来のAgelasine Dは、2015年に結核菌に対して抗菌作用を示すことが明らかとなり、またその標的タンパク質としてBCG3185cが明らかになった。申請者は本標的タンパク質BCG3185cが構造未知であること、さらにこれまでの抗生物質であるストレプトマイシンでは結合しなかったことから、多剤耐性結核菌の問題を解決する新規抗結核薬の開発に繋がるものと考え、まずはBCG3185cのタンパク質発現系および単離精製手法の確立に着手した。大阪大学蛋白質研究所の竹下先生の協力の下、BCG3185cの発現系の構築を行い、さらに精製手法を検討することで、標的タンパク質をかなりの高純度で単離精製することに成功した。次に、精製したBCG3185cについて、タンパク質の構造を解明するためにX線結晶構造解析法を用いることとし、そのためのBCG3185cの結晶化条件の検討を行った。その結果、良質な結晶を得ることに成功したため、大型放射光施設SPring-8にてX線を照射し、最終的に回折像を得ることが出来た。得られた回折像をもとに、構造解析を行った結果、ある程度の高分解能でBCG3185cの立体構造を明らかにすることが出来た。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前述したように、これまで、BCG3185cの結晶化に成功し、大型放射光施設SPring-8にて、X線を照射して回折像を得ることに成功してきた。得られた結晶構造は分解能もある程度高いため、詳細な構造を明らかにすることが出来た。一方、その中で、得られた結晶に金属であるニッケルが入っていることも明らかになった。一般的なタンパク質として、ニッケルが含まれるケースは少なく、特に今回、BCG3185cの精製過程でニッケル樹脂を用いたHisタグによる精製を行ったこともあり、精製過程を再度検討する必要が出てきた。ただし、タンパク質の構造としては大きな変化はないとも考えられるため、得られた結晶構造をもとに、まずはAgelasine Dの結合様式を、昨年度購入した高性能のコンピュータを用いたドッキングシミュレーションによって検討した。その結果、いくつかの結合状態が考えられたことから、現在、そのいずれが相応しいかを、変異体作製も視野に入れながら、検証している。一方、複合体の結晶化条件も検討するため、Agelasine D共存下でのBCG3185cの結晶化も遂行していた。しかしながら、前述したようにBCG3185cの精製方法を再検討する必要が出てきたため、現時点では複合体の結晶化については保留しており、この段階の再検討のために、進捗状況としては若干の遅れが出ているのが現状である。ただし、上記の点については新たな精製方法を構築している段階であり、タンパク質の物性として大きな変化は考えられないことから、精製方法が再確立されれば、結晶化はわずかな違いを検討するのみで、すぐに当初の計画に近い状態へと戻せることが十分に期待できる。
Strategy for Future Research Activity	『現在までの進捗状況』に記載したように、今後の研究としては、まずはBCG3185cの新たなタンパク質発現系および精製方法の確立が最重要任務である。その第一歩として現在、GSTとの融合タンパク質として発現および精製を行う手法を検討しており、すでに精製段階において良好な結果が出ている。本手法が確立された後、単離精製されたBCG3185cを用いて、速やかに結晶化条件の再検討を行う。その後、結晶が得られたら、同様にSPring-8にてX線を照射して回折像を得て、結晶構造解析を行う。新たな精製方法ではニッケルが含まれていない可能性が高いため、その点を確認した後、同様の条件でのAgelasine Dとの複合体の構造解析を目指し、Agelasine D存在下での結晶化を検討する。一方で、新たに得られる立体構造に対して、再度、コンピュータを用いたドッキングシミュレーションを実施する。また同時に、Agelasine Dとストレプトマインを用いて、BCG3185cとの結合親和性を再評価する。本手法には分担研究者である大阪大学の宇野先生に担当してもらい、分子間相互作用解析装置Biacore T200を用いることで、親和性の指標である解離定数を算出してもらう。さらに、大阪大学が所有する化合物ライブラリを用い、BCG3185cの更なる標的タンパク質をコンピュータを用いて検討しながら、さらにBiacore T200を再度用いて、ヒットするリード化合物を探索する。