2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
15K08222
|
|---|
| Research Institution | International University of Health and Welfare |
|---|
Principal Investigator |
升本 宏平 国際医療福祉大学, 保健医療学部, 講師 (60580529)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 神経連絡 / 軸索伸長 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類体内時計の中枢である視交叉上核は脳領域に時刻情報を伝え、その領域の概日振動の位相を制御する。しかしながら、視交叉上核の時刻情報がどの様に脳領域に伝わり、どの様に概日振動を制御しているのかは未だに明らかにされていない。申請者が独自開発した“移植培養系での振動再構成”によって、時刻情報伝達には物理的結合が重要であることがわかった。そこで本研究では、視交叉上核と室傍核領域の物理的結合を担う神経連絡、グリア細胞が時刻情報伝達機構においてどのような機能を担っているのか明らかにすることにした。
前年度の研究において、室傍核領域由来のグリア細胞の移植では、室傍核領域全体の振動は回復せず、また一細胞レベルの振動もすぐに減衰、消失した。このことから室傍核領域と視交叉上核の同期には神経連絡を介した時刻情報の伝達が必要であると考えられた。
そこで本年度は、振動の回復を担う候補因子の探索のために、網羅的遺伝子発現解析のデータベース（http://brainstars.org/）を参照して、視交叉上核で発現し、その受容体が室傍核領域にあるものを候補とした。候補の絞り込みにおいては、実際に受容体が室傍核領域で発現していることをin situ hybridization法、免疫染色によって確認した。また、得られたデータを詳細に解析することにより、振動が回復する領域、しない領域など新たな知見を得ることができた。
現在、いくつか候補因子を検討した結果、時刻情報伝達因子の第一候補としてGABAの検証を行っている。GABA受容体のアゴニストの投与により発光が抑制され、またアンタゴニストの投与により、室傍核領域と視交叉上核間の振動の位相差が消失した。さらなる検証を引き続き行っており、動物個体での検証も行っている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では物理的結合を介した時刻情報伝達機構について明らかにするために、1. 神経連絡及びグリア細胞が時刻情報の何を制御しているか、2. 時刻情報伝達の中継及び受容に概日時計は必要であるか、の2項目を軸として研究を推進していく。
本年度は、所属を変更したため、研究環境が大きく変更してしまい、新たに実験系を立ち上げるために時間を要してしまった。また発光系に用いる機器の移設の遅れ、本研究で用いる時計遺伝子Per2のプロモータにルシフェラーゼを結合させたmPer2Lucマウスの出生率低下による導入の遅れなどから、当初予定より変更して、in situ hybridization、免疫染色による実験を優先させた。
1．神経連絡及びグリア細胞が時刻情報の何を制御しているか、に関して検証を行った結果、室傍核領域の概日振動回復には神経連絡を介した時刻情報の伝達が必要であることがわかった。さらに、候補因子をいくつか探索した結果、GABAが有力な時刻情報伝達物質である可能性を見出すことができた。
2．時刻情報伝達の中継及び受容に概日時計は必要であるか、に関して検証を行った。室傍核領域におけるGABA受容体にアゴニストで刺激を与えたところ、その反応に時刻依存性を確認することはできなかった。このことは時刻情報の伝達には受け取り側の概日時計は必要ないことを示唆しており、視交叉上核から放出される時刻情報伝達物質の位相によって、視交叉上核と室傍核領域の位相差が決まるのではないかと考えることができる。
新たに得られた知見はいくつもあるが、所属先変更による実験系の立ち上げに時間を要したために、本研究は予定よりやや遅れていると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在までに得られているデータを詳細に解析したことで新たに得られた知見が多くあるので、1．神経連絡及びグリア細胞が時刻情報の何を制御しているか、の神経連絡の必要性までについて論文にまとめる。これに加えて、
1．神経連絡及びグリア細胞が時刻情報の何を制御しているか、についてはGABAについてさらなる検証を加える。GABAは細胞内クロライドの濃度によって、抑制、興奮性が変化する。そこで、クロライドのトランスポーターを抑制することにより、その反応性を検証する。反応性が変化するようであればマウスを用いた実験を行う。マウスを明暗条件下で飼育し、赤外線センサーを用いて行動を測定、脳室内に抑制剤を投与し、夜間に行動するマウスの活動リズムが昼行性動物のように昼間に行動するようになるか確認する。また引き続き、周期の同調、位相の同期を担うGABA以外の因子を探索する。特に、周期の同調、位相の同期は必ずしも同一の因子で達成されているという保証はなく、GABAにおいては周期の同調を担っていると考えているが、確定させるためにさらなる検証を行う予定である。
2. 時刻情報伝達の中継及び受容に概日時計は必要であるか、についてさらなる検証を行う。そのために概日時計が消失したマウス脳由来の室傍核領域スライスに通常の視交叉上核を移植し、振動の回復を確認する。また周期長の異なるマウス由来の視交叉上核を移植することで、室傍核領域と視交叉上核の位相差がどのようになるか確認する。
所属先変更により、不足してた機材やマウスの導入をすみやかに行う。
|
| Causes of Carryover |
所属を変更したため、研究環境が大きく変更してしまい、それに伴い新たに実験系を立ち上げるために時間を要してしまった。保有している機材が前所属先と大きく異なり、その関係でin situ hybridization、免疫染色を優先することになり、高価な消耗品を使用する組織培養を行う機会が減ってしまった。その結果、消耗品の使用量が予定より少なくなった。また発光系にmPer2Lucマウスの出生率低下による導入の遅れも組織培養を行う機会の減少の要因である。
施設における共通試薬、消耗品の使用により、購入費が抑えられたのも一因である。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越分は次年度において、遺伝子組換えマウス導入費、発光測定機器の導入に用いる。また、組織培養用メンブレンを含めた組織培養を行うために必要な消耗品、免疫染色に用いる抗体の購入にあてる。
|
