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2015 Fiscal Year Research-status Report

輸送体群を束ね局在を制御する腎尿細管上皮細胞新規膜タンパク質の機能の解明

Research Project

Project/Area Number 15K08274
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

永森 收志  大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90467572)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 大垣 隆一  大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20467525)
奥田 傑  大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50511846)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords膜輸送複合体 / プロテオミクス / 腎臓 / トランスポーター
Outline of Annual Research Achievements

研究代表者は、多数の近位尿細管管腔側膜輸送体と共に発現変動する遺伝子を、バイオインフォマティクスによって見出した。 その遺伝子がコードするタンパク質TRAPは、腎特異的に発現する新規膜タンパク質であり、近位尿細管管腔側膜 に局在した。TRAPノックアウトマウスは、Fanconi症候群類似の、糖・アミノ酸・尿酸の尿中排泄の顕著な上昇を示し、さらにそれらを輸送可能な複数の輸送体の局在が変化していた。 野生型マウスにおいてTRAPが様々な輸送体と複合体を形成していることから、TRAPと相互作用する管腔側膜輸送体群の全体像と、それら輸送体の局在をTRAPが制御する機構を明らかにすることを目指した。網羅的比較定量プロテオミクスにより、TRAPの欠失により発現量の影響を受ける輸送体を明らかにした。また、免疫染色により、TRAPが輸送体の局在を規定することを示す結果を得た。さらに、TRAPがどのように一群の管腔側膜輸送体と結合するかを明らかにした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

網羅的比較定量プロテオミクスによるTRAPノックアウトマウス尿細管輸送体の変動解析をおこなった。近位尿細管で再吸収されるはずの栄養素や代謝物が尿中へ漏出する場合、それらの再吸収を担う輸送体の分子の機能自体が低下しているか、あるいは管腔側膜上での存在量が低下しているかの2つの可能性がある。TRAPノックアウトマウスの管腔側膜上での各輸送体の存在量を野生型マウスと比較することにより、TRAPの役割についての重要な情報を得た。変化が見いだされた輸送体のうち、いくつかについては、Western blotでその変化を確認するとともに、免疫染色を行い輸送体タンパク質の局在の変動を検討した。さらに高空間分解顕微鏡SIM (Structured illumination microscopy)を用いることで、TRAPノックアウトマウスにおいて、局在市の変化を示す輸送体の一部について、より正確な輸送体の局在位置の変化を把握することに成功した。さらに、尿細管管腔側膜画分膜小胞を調整し、複数の化合物の輸送機能を、アイソトープラベルした基質を用いて測定し、TRAPノックアウトマウスにおける輸送体の発現量変動と機能変化について、定量的な解析を進めた。 加えて、 管腔側膜輸送体の機能を維持するTRAPの役割の解析のために、抗TRAP抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降物を質量分析計で解析し、輸送体との複合体形成の有無を検討し、TRAPがどのように一群の管腔側膜輸送体と結合するかを明らかにした。

Strategy for Future Research Activity

これまでの詳細な検討から、近位尿細管管腔側膜輸送体のうち、TRAPと連携するものとしないものが明らかになる。TRAPと連携するものに存在し、連携しないものには存在しない、コンセンサス配列を探し、培養細胞発現系を用いた変異導入の解析により、輸送体がTRAPと連携するために必要な構造を明らかにする。輸送体がTRAPと連携するために必要な構造が明らかになると、それと相互作用するTRAPの構造も予測できる。同様に変異導入解析により、TRAPが輸送体と 相互作用するために必要な構造を決定する。
さらに、 TRAP自身が細胞膜移行に必要なTRAPの構造を明らかにする。いくつかの膜タンパク質においてC-末端の細胞内ドメインに細胞膜移行に必要な構造が見られるため、TRAPにおいても、C-末端そしてN-末端の部分欠損変異を作製し、部位特異的変異導入を併用して、TRAPの管腔側膜移行に必要な構造を決定する。そしてその変異が、共発現させた輸送体も引き連れた形で膜移行を阻害するかどうかを検討する。
TRAPとの物理的相互作用もしくはKOマウスにおける発現量の減少が見られている輸送体の中には、培養細胞にその遺伝子をトランスフェクションした場合、著しく発現量が低いものや輸送機能を示さないものが含まれていた。そこで、それらの輸送体とTRAPの共発現細胞を作成し、in vitro でTRAPの機能を発現することを試みる。TRAP以外の因子が、TRAPの機能発現に必要な場合も想定し、TRAPと複合体を形成する輸送体以外の因子についても検討を進める。TRAP機能のin vitro解析系を用いて、TRAP機能の分子機構の全体像を明らかにする。

Causes of Carryover

物品の購入価格が,当初の見積額から変動したために若干の次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究の進展により当初より旅費が必要となっているため、旅費に使用する予定である。

  • Research Products

    (18 results)

All 2016 2015 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 6 results,  Acknowledgement Compliant: 4 results,  Open Access: 2 results) Presentation (10 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 10 results)

  • [Int'l Joint Research] IRB Barcelona/CIBERER/Universitat de Barcelona(Spain)

    • Country Name
      Spain
    • Counterpart Institution
      IRB Barcelona/CIBERER/Universitat de Barcelona
    • # of Other Institutions
      1
  • [Journal Article] Structure-activity relations of leucine derivatives reveal critical moieties for cellular uptake and activation of mTORC1-mediated signaling.2016

    • Author(s)
      Nagamori S, Wiriyasermkul P, Okuda S, Kojima N, Hari Y, Kiyonaka S, Mori Y, Tominaga H, Ohgaki R, Kanai Y.
    • Journal Title

      Amino Acids

      Volume: 48 Pages: 1045-58

    • DOI

      doi: 10.1007/s00726-015-2158-z

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Specific transport of 3-fluoro-l-α-methyl-tyrosine by LAT1 explains its specificity to malignant tumors in imaging.2016

    • Author(s)
      Wei L, Tominaga H, Ohgaki R, Wiriyasermkul P, Hagiwara K, Okuda S, Kaira K, Oriuchi N, Nagamori S, Kanai Y.
    • Journal Title

      Cancer Sci.

      Volume: 107 Pages: 347-52

    • DOI

      doi: 10.1111/cas.12878

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Clinicopathological significance of LAT1 and ASCT2 in patients with surgically resected esophageal squamous cell carcinoma.2016

    • Author(s)
      Honjo H, Kaira K, Miyazaki T, Yokobori T, Kanai Y, Nagamori S, Oyama T, Asao T, Kuwano H.
    • Journal Title

      J Surg Oncol.

      Volume: 113 Pages: 381-9

    • DOI

      doi: 10.1002/jso.24160.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Transport of 3-fluoro-l-α-methyl-tyrosine (FAMT) by organic ion transporters explains renal background in [(18)F]FAMT positron emission tomography.2016

    • Author(s)
      Wei L, Tominaga H, Ohgaki R, Wiriyasermkul P, Hagiwara K, Okuda S, Kaira K, Kato Y, Oriuchi N, Nagamori S, Kanai Y.
    • Journal Title

      J Pharmacol Sci.

      Volume: 130 Pages: 101-9

    • DOI

      doi: 10.1016/j.jphs.2016.01.001

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Novel cystine transporter in renal proximal tubule identified as a missing partner of cystinuria-related plasma membrane protein rBAT/SLC3A1.2016

    • Author(s)
      Nagamori S, Wiriyasermkul P, Guarch ME, Okuyama H, Nakagomi S, Tadagaki K, Nishinaka Y, Bodoy S, Takafuji K, Okuda S, Kurokawa J, Ohgaki R, Nunes V, Palacín M, Kanai Y.
    • Journal Title

      Proc Natl Acad Sci U S A.

      Volume: 113 Pages: 775-80

    • DOI

      doi: 10.1073/pnas.1519959113

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Molecular architecture of the stria vascularis membrane transport system, which is essential for physiological functions of the mammalian cochlea.2015

    • Author(s)
      Uetsuka S, Ogata G, Nagamori S, Isozumi N, Nin F, Yoshida T, Komune S, Kitahara T, Kikkawa Y, Inohara H, Kanai Y, Hibino H.
    • Journal Title

      Eur J Neurosci.

      Volume: 42 Pages: 1984-2002

    • DOI

      doi: 10.1111/ejn.12973

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] プロテオミクスによるアミノ酸輸送と介在シグナルの全体像の解明2015

    • Author(s)
      永森收志
    • Journal Title

      アミノ酸研究

      Volume: 9 Pages: 73-77

  • [Presentation] Significance of comprehensive and quantitative proteomics of membrane transport proteins in drug discovery.2016

    • Author(s)
      Nagamori S.
    • Organizer
      第89回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      横浜市
    • Year and Date
      2016-03-11
    • Invited
  • [Presentation] A renal tubular transporter mediating reabsorption of β-hydroxybutyrate: a potential target of drugs increasing urinary ketone body excretion.2016

    • Author(s)
      Nagamori S.
    • Organizer
      第89回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      横浜市
    • Year and Date
      2016-03-10
    • Invited
  • [Presentation] Non-competitive inhibitors arrest the alternating-access mechanism of amino acid transporters.2015

    • Author(s)
      Nagamori S.
    • Organizer
      第38回分子生物学会年会・第88回生化学会大会合同大会(BMB2015)
    • Place of Presentation
      神戸市
    • Year and Date
      2015-12-02
    • Invited
  • [Presentation] プロテオミクスによるアミノ酸輸送と介在シグナルの全体像の解明2015

    • Author(s)
      永森收志
    • Organizer
      アミノ酸学会第9回学術大会
    • Place of Presentation
      彦根市
    • Year and Date
      2015-10-23
    • Invited
  • [Presentation] 網羅的定量プロテオミクスと機能解析によるがん細胞株アミノ酸トランスポーターのプロファイリング2015

    • Author(s)
      永森收志
    • Organizer
      平成27年度生理研研究会「生体ホメオスタシスの gatewayとしての上皮膜輸送マイクロホメオスタシス機構」
    • Place of Presentation
      岡崎
    • Year and Date
      2015-09-15
    • Invited
  • [Presentation] 網羅的プロテオーム解析が捉えるアミノ酸トランスポーターによる生体システムの制御2015

    • Author(s)
      永森收志
    • Organizer
      平成27年(第96回)日本栄養・食糧学会関東支部大会シンポジウム
    • Place of Presentation
      新潟市
    • Year and Date
      2015-09-05
    • Invited
  • [Presentation] 生体界面構成因子の定量的解析に向けた膜タンパク質定量プロテオミクス2015

    • Author(s)
      永森收志
    • Organizer
      平成27年度生理研研究会「生体界面研究会」
    • Place of Presentation
      岡崎
    • Year and Date
      2015-07-17
    • Invited
  • [Presentation] アミノ酸トランスポーターとD-アミノ酸輸送2015

    • Author(s)
      永森收志
    • Organizer
      第15回日本蛋白質科学会
    • Place of Presentation
      徳島市
    • Year and Date
      2015-06-24
    • Invited
  • [Presentation] アミノ酸トランスポーターを標的とした創薬研究2015

    • Author(s)
      永森收志
    • Organizer
      第10回日本トランスポーター研究会
    • Place of Presentation
      東京都港区
    • Year and Date
      2015-06-21
    • Invited
  • [Presentation] Metabolomics and proteomics of knockout mice reveal physiological function of an orphan organic anion transporter.2015

    • Author(s)
      Nagamori S.
    • Organizer
      The 3rd Awaji International Workshop on “Electron Spin Science & Technology: Biological and Materials Science Oriented Applications”
    • Place of Presentation
      兵庫県淡路島
    • Year and Date
      2015-06-15
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2017-01-06  

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