miR449aによるがん抑制の分子メカニズムの解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08307
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 西田 純 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 助教 (00361981)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: miR449a / がん

Outline of Annual Research Achievements

Notchは生体の発生や細胞分化に機能しているシグナル分子群である。私達はNotchシグナルが制御するマイクロRNAを検索し、miR449aを見いだした。近年の研究から、miR449の発現とがん発生の関連がいくつか報告されている。例えば、肺がんや胃がん患者のがん組織においてmiR449の発現量が正常組織に比べ低下しており、その発現量ががんの悪性度と相関している事が明らかとされた。また、これらの報告では、in vitroの解析によりmiR449がp53経路の活性化を引き起こす事、また、サイクリン依存キナーゼ6の発現調節を行っている事が明らかにされ、miR449の発現低下がアポトーシスの阻害や細胞分裂異常を引き起こし、がん発生に関与する事が示唆された。しかしながら、これらの報告はin vitroの解析を基にしたものであり、miR449aが生体内でがん化に関与しているかは未だ不明であり、その分子メカニズムも明らかになっていない。
これまでに私達は大腸がん患者のがん組織におけるmiR449aの発現を解析した。その結果、前述の報告と同様に悪性度が高いがんで、miR449aの発現が低下している事が明らかとなった。さらに、がん部におけるmiR449aの発現量と患者の予後の関連を調べたところ、miR449aが低発現であったがん患者は予後が不良であった。さらに、私達はmiR449a欠損マウスを樹立し、アゾキシメタン（AOM)/DSS誘導性大腸がんモデルを用い、miR449aとがん化の関連について解析をした。その結果、miR449a欠損マウスでは野生型マウスに比べ多くの大腸がんが発生した。この結果は、各種がんにおけるmiR449aの発現低下はがん化の結果起こった事象ではなく、miR449aの発現低下が発がんを誘発し、悪性化させる一つの因子である事を強く示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

(1)-a. マイクロアレイを用いた新規miR449aターゲット分子の検索
miR449aが欠失する事によって影響を受ける分子について、マイクロアレイを用いて網羅的に解析を行った。miR449a欠損マウスと野生型マウスの大腸を上部と下部に分け、それぞれからトータルRNAを調製し、マイクロアレイを行った。その結果、 欠損マウスの大腸上部、下部ともに、大腸がんに関連があるがん抑制遺伝子の発現が 野生型と比べ２５％程度まで低下していた。マウス大腸癌細胞株CT26にmiR449a発現ベクター又は空ベクターを導入し、それら細胞からRNAを抽出し、リアルタイムPCRにより大腸がんに関連する前がん遺伝子の発現を調べた。その結果、miR449aを発現させた細胞では前がん遺伝子の発現の低下が見られた。これら結果から、miR449aはこれらがん関連遺伝子の発現を調節する事により細胞のがん化の抑制に働く事が示唆された。
(2)-a. miR449aの細胞動態への影響
AOM/DSSにより大腸がんを誘導したマウス大腸のパラフィン切片を作製し、細胞増殖マーカーのKi67で染色を行った。その結果、野生型と比べmiR449a欠損マウスでは大腸の陰窩の基底部側においてKi67陽性細胞が有為に増加していた。この結果はmiR449aの欠損によって大腸陰窩の基底部細胞の増殖が促進されたことを示唆する。
(2)-b. 大腸がん移植モデルを用いたmiR449aのがん形成への関与
miR449a又は空ベクターを導入したCT26細胞から単クローン細胞株を樹立し、それらをBalb/cマウスの皮下へ移植しがん形成への影響を調べた。しかしながら、両者の間の腫瘍の増大に差は見られなかった。

Strategy for Future Research Activity

(1)-b. プロテオーム解析を用いた新規miR449aターゲット分子の検索　野生型及びmiR449a欠損マウスの大腸組織から細胞抽出液を調製し、二次元電気泳動を用いたプロテオーム解析を行いmiR449aのターゲット分子を検索する。これら解析から、マイクロアレイでは検出されなかったターゲット分子が見つかる可能性が考えられる。得られたデータとmicroRNAデータベースの情報を照合し、miR449aターゲット分子の候補を絞り込む。培養細胞にmiR449aを強制発現もしくは発現抑制させ、その発現が抑制されるかウエスタンブロットやRT-PCR法などで確認する。
(2)-b. 大腸がん移植モデルを用いたmiR449a及びそのターゲット分子のがん形成への関与　大腸がん移植実験ではmiR449a又は空ベクターを導入した細胞株を各２クローンずつ用いたが、クローン間の差が大きく有為な差は見られなかった。原因として、単クローン樹立の間に細胞の形質が変化した可能性が考えられる。用いるクローンの数を増やし解析を行う事により、その問題が改善されると考えられる。また、形成させたがんを回収し、大きさや細胞の分化度、組織への浸潤など組織学的に解析し、がん形成に対するmiR449aの働きを解析する。また、miR449aのターゲット分子についても同様に解析する。
(3)-a. miR449a発現調節機構の解析　miR449aの発現調節機構を明らかにするために、第二イントロンにmiR449aを持つCDC20Bのプロモーター領域の解析を行う。miR449aはNotchシグナルによって発現が制御され、CDC20B遺伝子付近にはNotchによる転写制御を司る転写因子Rbpjの結合配列が転写開始点上流約450bp付近など複数箇所存在する。そこで、ChIPアッセイによりRbpjがそれら結合配列に結合しているかを解析する。また、CDC20Bのプロモーター領域を組み込んだレポーターベクターを構築し、Rbpjの発現によりその転写が制御されるかも解析する。