2015 Fiscal Year Research-status Report
アポトーシス抵抗性乳癌細胞における癌幹細胞表現型の解析
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15K08411
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| Research Institution | Doshisha Women's College of Liberal Arts |
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Principal Investigator |
高橋 玲 同志社女子大学, 薬学部, 教授 (60144565)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 癌幹細胞 / アポトーシス / 前駆細胞 / 分化誘導 / p53 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ヒト乳癌細胞集団において、Ａ：p53発現誘導による細胞死に感受性を示さない少数の細胞（p53誘導型細胞死耐性群）、Ｂ：細胞分化を示さず、すべての階層hierarchyを再構築できる少数の幹細胞（癌幹細胞群）、というA,B両方の性質を示すという条件で抽出された小細胞群を元の集団の性質と比較検討することを進めてきた。乳癌細胞HCC1937の形態学的特徴として小型から大型の細胞が含まれる。これは単一細胞クローニング後にも同様の形態を示すことを確認した。同細胞のp53遺伝子には306CGA->TGA終止コドンが生じており、これにDOXでwild-type p53遺伝子の発現誘導ができるプラスミドを安定的に導入したHCC1937/DOXp53を作成した。in vitro およびin vivoのp53発現誘導によって、大部分の細胞が24hをピークとしてp53の発現亢進および引き続いてアポトーシスが誘導される。p53発現亢進した癌細胞はアポトーシスに陥るが、ごく少数約1-3%の細胞が生き残る。それらは、p53を高いレベルで発現し,Ki-57indexが高い(>90%) 細胞群が主体であることを示した。ALDH1陽性を示す細胞が多く含まれることから乳癌幹細胞の性質を有することが明らかとなった。また、癌幹細胞のマーカーの一つであるSox-2遺伝子発現も相関関係を示した。一方乳管分化誘導に関係するGATA3遺伝子発現はALDH１やSox-2の発現に遅れて出現し、アポトーシスを免れた乳癌幹細胞が自己複製後にhierarchy構築のための分化を示す細胞を生み出していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々の実験系で得られたp53発現誘導によるアポトーシス抵抗性を示す細胞（p53/アポトーシス耐性細胞群については、解析が進められている。今までに報告されている乳癌幹細胞のCD44-CD24-/low細胞によるソーティングとの比較をするために、CD44とCD24に対する抗体の評価や条件検討をFACS上で行ってきた。in vitroとin vivoにおいてp53誘導アポトーシスに抵抗性を示す細胞として分離されたものが、各種の分化マーカー発現態度および細胞形態の点から幹細胞としての性格を有する細胞であるかどうかを検討するという点については、in vitro実験系を先行して進めている。1) p53/アポトーシス耐性細胞の細胞周期の検討している。DOX添加状態でさらに培養を続けた場合、見かけの細胞数はほとんど増えない。しかし、そのp53/アポトーシス耐性細胞群でのKi-67インデックスは>90%である。TUNEL法でのアポトーシスの検出率も30-50%と高値を示す。したがって、p53/アポトーシス抵抗細胞群は、静止期の細胞集団ではなく、大部分の細胞は細胞回転が亢進し、かつアポトーシスに陥っていく細胞であるという確認ができた。2)分化マーカーの発現については、乳管形成誘導因子であるGATA3の発現を免疫染色、RT-PCR、FACSによって継時的に解析できる条件が整った。3) CD44-CD24-/low細胞とp53/アポトーシス耐性細胞の比較については、FACSにおける3重染色を構築することで従来のわれわれの指標であるALDH1,Sox-2との関係を直接比較検討することができるようになった。さらにはEMTに関係するSNAI2、E-cadherin、vimentinなどのマーカー発現の変化をとらえる準備を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今までのin vitro実験系に平行して、形態学的特徴や組織内での細胞集団のふるまいについて検討するためにxenograftを作成してin vitroとin vivoの比較対照を行う。HCC1937/DOXp53細胞をヌードマウス皮下に移植する。２週間後に形成された腫瘍(平均5mmx5mm)を持つマウスにDOXを飲水投与し、経時的に腫瘍を摘出して組織学的に検討する。腫瘍はDOX投与を継続すると縮小するが、３ヶ月後に少数の細胞が残存する。組織をホルマリン固定後に薄切して切片上で免疫染色やその他の検出を行う。まず、DOX飲水投与でp53発現誘導（p53免疫染色）が生じるかどうかを経時的に確かめる。今までの予備実験では２時間後から誘導が始まり24時間でピークに達することが明らかになっている。１）細胞増殖回転（Ki-67 index）およびアポトーシス(TUNEL法)に陥る細胞の頻度を解析する。２）分化マーカーやEMT関係遺伝子(GATA3、SANAI2、E-cadherin、vimentinなど)の発現様式変化を数値化して検討する。３）巨細胞を含めた細胞形態の比較（flatな細胞や巨核細胞の数の増減を計測する）４）Slow growingあるいはLabeling retaining細胞をin vivo BrdU標識法で検討する。５）p53/アポトーシス耐性細胞が、少ない細胞数（1x104～105個）で造腫瘍性を示すかどうかを調べる。６）ＣＤ44-ＣＤ24-/loｗ細胞およびALDH1陽性細胞についても同様の実験を行なう。in vitroとin vivoでの結果に違いが出た場合には、生体内の種々の影響を考慮して調べる。特に乳癌の場合はホルモン環境など生体内での増殖、分化に影響を与える要素が癌幹細胞群の表現型に与える影響を無視できない。
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Research Products
(4 results)
