2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K08650
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
王寺 典子 (下嶋典子) 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (30398432)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 利洋 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (00595712)
石谷 昭子 奈良県立医科大学, 医学部, 非常勤講師 (40112544)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | HLA-F / 腫瘍 / 大腸癌 / 免疫染色 / ホルマリン標本 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HLA-Fは、非古典的HLA クラスI 遺伝子に分類されるHLA遺伝子で、多型性に乏しく、胎盤トロホブラスト、B細胞、活性化リンパ球の細胞表面に発現することが報告されている。
また、これまでの研究からHLA-Fが多様な発現様式を持つことが明らかになっている。
我々は新鮮凍結標本を使用したこれまでの研究で、HLA-Fが悪性度の高い腫瘍により強く発現することを見出している。本研究では、より多くの腫瘍標本における解析を可能にするため、ホルマリン標本を用いたHLA-F発現解析方法を確立し、HLA-Fの発現解析を行うことで、HLA-Fの腫瘍マーカーとして有用性、さらにはHLA-Fと腫瘍増悪化、予後低下との関連について明らかにすることを目的としている。
今年度は、昨年度から引き続き、HLA-Fの発現様式の違いを識別できる6種の抗HLA-Fモノクローナル抗体を用いて、ホルマリン標本における染色条件の検討を行った。その結果、6種のうち、5種の抗HLA-Fモノクローナル抗体がホルマリン標本で使用可能であることを確認できたが、より高感度に検出可能な条件を確立めざし、詳細な条件検討を行っている。また低分化・中分化・高分化の大腸癌および正常大腸の細胞株を使用して、HLA-Fの発現解析を行い、細胞質にHLA-Fが発現することを確認した。しかし、ウエスタンブロッティング、FACS、qPCRにおける解析結果が一致しておらず、現在、これらの結果の検証中である。今後は、6種全ての抗HLA-Fモノクローナル抗体の染色条件を確立し、組織標本を用いてHLA-Fの発現様式の違いと腫瘍悪性度との関連、細胞株を用いて、HLA-Fの局在と腫瘍悪性度との関連を明らかにし、これまで得られた結果を検証すると共に、HLA-Fの腫瘍マーカーとしての有用性等について明らかにすることを目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度も昨年度同様、6種の抗HLA-F抗体のホルマリン標本染色法の確立および大腸癌などの腺癌を中心に解析を始めること、in vitro解析のためのHLA-F陽性細胞株の検索を目標として本研究を進めてきた。
その結果、6種のうち5種の抗HLA-Fモノクローナル抗体がホルマリン標本に使用可能であることを確認できた。しかし、さらに検出方法の精度向上をめざし、条件検討を重ねる予定である。また、HLA-F陽性細胞株の検索については、現在7種の低分化・中分化・高分化の大腸癌細胞株を用いて検討しているが、いずれもフローサイトメトリーでは細胞葉面にHLA-F陰性であり、細胞質にはHLA-Fを確認できた。一方、免疫染色を行ったところ、細胞表面付近にもHLA-Fの発現が見られるものもあり、現在、HLA-Fの細胞内局在については、詳細に解析中である。
研究計画2年目の到達目標であったホルマリン標本の染色法の確立と、HLA-F陽性の腫瘍細胞株の検索が達成できていないため、現在までの達成度は「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究において、ホルマリン標本における免疫組織染色条件の確立は必須項目であるので、平成28年度に検討した染色条件の問題点を早期に解決し、あらゆる標本に使用可能となる染色条件の確立を目指す。一方で、6種の抗HLA-F抗体のうち5種の抗HLA-F抗体がホルマリン標本の免疫染色に使用可能であることが確認できたことは、本研究を継続する上で非常に重要で、さらに検出精度の高い条件を検討すると共に、残り1種の抗HLA-F抗体の染色条件の確立を急ぎ、まずは大腸癌を中心に解析をすすめる。
HLA-F陽性腫瘍細胞株については、HLA-Fの細胞における局在部位をフローサイトメトリー、免疫染色で明らかにする。細胞におけるHLA-Fの発現について、ホルマリン標本の結果との整合性をとり、腫瘍細胞におけるHLA-Fの発現が分化度に関連するのか、腫瘍マーカーとして有用であるのかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
抗HLA-F抗体のホルマリン標本の免疫組織染色条件が確立できていないことから、多重染色に使用する抗体等の購入を控えた。また、腫瘍細胞株におけるHLA-F発現解析も継続中であり、HLA-F陽性細胞株を使用して行う予定であったHLA-Fノックダウン細胞株、あるいは高発現細胞株の作製も遅れているため、これに関連する試薬の購入も控えた。以上の点から、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ホルマリン標本に使用可能な腫瘍マーカー等多重染色に使用する抗体を購入する。（腫瘍マーカー、TAM マーカー ￥50,000/100ug×4 本（条件検討のため）＝￥200,000―、免疫染色用2 次抗体（FITC 標識、PE 標識等）￥50,000/本×4 本（多重染色を行うため、動物種の違うものを揃える）＝￥200,000―、免疫染色用2 次抗体（HRP 標識）（ニチレイ シンプルステインkit） ￥100,000/kit×2＝￥200,000―）。HLA-F陽性細胞株を使用したHLA-Fノックダウン細胞株、あるいは高発現細胞株の作製のため、CIRSPR/Cas9 ベクターキット（ ￥131,000/kit×2=￥262,000―）を購入する。その他細胞株培養のための培養用消耗品を購入する（\156,770－）。
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