複製複合体を含む膜小胞でのC型肝炎ウイルスの複製メカニズムの解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09034
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 相崎 英樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (00333360)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: C型肝炎ウイルス / 複製複合体 / 膜小胞

Outline of Annual Research Achievements

ポリオウイルス, SARSコロナウイルス, マウス肝炎ウイルス等のプラス鎖RNAウイルスは複製複合体を含む膜小胞を形成しその中で複製することが知られているが、そのメカニズムについては不明である。本研究ではC型肝炎ウイルス(HCV)をモデルに、プラス鎖RNAウイルスの複製の場である膜小胞形成および複製のメカニズム解析を目指す。
HCVNS4BはHCV複製に関与する膜小胞の形成に重要な役割を果たしていることが知られているので、NS4Bと結合する膜タンパクを同定し、そのタンパクの複製における役割について解析した。プロテオーム解析およびsiRNAスクリーニングにて、NS4B結合膜タンパクとしてprolactin regulatory element binding protein (PREB)を見出した。PREBはSec12とも呼ばれ、COPIIを介した小胞体輸送に関与するタンパクとして知られている。免疫沈降、免疫染色、proximity ligation assayにて、NS4Bのaa141-190とPREBのaa1-110領域が結合していることを確認した。HCV擬似ウイルス、レプリコン、HCVJFH1株を用いた解析により、PREBはHCVの侵入、翻訳、粒子形成の過程には関与しておらず、複製に重要な役割を果たしていた。レプリコン細胞の免疫染色により、PREBはNS4Bと結合することにより、新規HCVRNA合成を示すBrUTPおよびdouble-strand RNAと共局在が観察され、生化学的な解析により、PREBはNS4Bと結合し複製複合体が含まれる界面活性剤不溶性分画に移行することが見出された。
HCVNS4B結合膜タンパクとしてPREBを見出した。PREBはHCV複製に重要な役割を果たしていると考えられ、そのメカニズムの解析を目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

プロテオーム解析およびsiRNAスクリーニングにて、NS4B結合膜タンパクとしてprolactin regulatory element binding protein (PREB)を見出した。PREBはSec12とも呼ばれ、COPIIを介した小胞体輸送に関与するタンパクとして知られている。免疫沈降、免疫染色、proximity ligation assayにて、NS4Bのaa141-190とPREBのaa1-110領域が結合していることを確認した。HCV擬似ウイルス、レプリコン、HCVJFH1株を用いた解析により、PREBはHCVの侵入、翻訳、粒子形成の過程には関与しておらず、複製に重要な役割を果たしていた。レプリコン細胞の免疫染色により、PREBはNS4Bと結合することにより、新規HCVRNA合成を示すBrUTPおよびdouble-strand RNAと共局在が観察され、生化学的な解析により、PREBはNS4Bと結合し複製複合体が含まれる界面活性剤不溶性分画に移行することが見出された。以上のように、HCV複製に関与する因子を見出し、当初の目的は達した。

Strategy for Future Research Activity

今後はPREBがどのように複製に関わっているか解析する。まず、レプリコン細胞をPREB siRNA処理し、電験観察を行い、膜小胞に与える影響を解析する。さらに、PREB siRNAを投与したレプリコン細胞の界面活性剤不溶性分画をproteaseまたはnuclease処理し、HCVNSタンパクおよびHCVRNAがprotease・nuclease感受性なるかどうかにより、HCVNSタンパクおよびHCVRNAを保持する膜小胞構造の形成・維持に与えるPREBの役割を解析する。レプリコン細胞、感染細胞、感染ヒト肝キメラマウスの肝組織において、PREBの発現の増減について解析する。

Causes of Carryover

siRNAで多くのホスト因子のスクリーニングを行う予定でしたが、細胞全体のプロテオーム解析に比べて、生体膜を精製後のプロテオーム解析したため、スクリーニングにかかる数が大幅に減らすことができた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

候補淡白について、siRNA処理後電験で確認作業をする予定である。

Research Products

• [Journal Article] Single-domain intrabodies against HCV Core inhibit viral propagation and Core-induced NF-κB Activation. (2016)
  • Author(s): Suzuki R, Saito K, Matsuda M, Sato M, Kanegae Y, Shi G, Watashi K, Aizaki H, Chiba J, Saito I, Wakita T, Suzuki T.
  • Journal Title: J Gen Virol. Volume: 97(4) Pages: 887-92
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Prolactin regulatory element binding protein is involved in hepatitis C virus replication compartment by interacting with NS4B. (2016)
  • Author(s): Kong L, Fujimoto A, Nakamura M, Aoyagi H, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Arita M, Yamagoe S, Dohmae N, Suzuki T, Sakamaki Y, Ichinose S, Suzuki T, Wakita T, Aizaki H.
  • Journal Title: J Virol. Volume: 90(6) Pages: 3093-111
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Novel Tricyclic Polyketide, Vanitaracin A, Specifically Inhibits the Entry of Hepatitis B and D Viruses by Targeting Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide. (2015)
  • Author(s): Kaneko M, Watashi K, Kamisuki S, Matsunaga H, Iwamoto M, Kawai F, Ohashi H, Tsukuda S, Shimura S, Suzuki R, Aizaki H, Sugiyama M, Park SY, Ito T, Ohtani N, Sugawara F, Tanaka Y, Mizokami M, Sureau C, Wakita T.
  • Journal Title: J Virol. Volume: 89 Pages: 11945-53
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Dysregulation of Retinoic Acid Receptor Diminishes Hepatocyte Permissiveness to Hepatitis B Virus Infection through Modulation of NTCP Expression. (2015)
  • Author(s): Tsukuda S, Watashi K, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Okada M, Sugiyama M, Kojima S, Tanaka Y, Mizokami M, Li J, Tong S, Wakita T.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 27 Pages: 5673-84
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Targeting cellular squalene synthase, an enzyme essential for cholesterol biosynthesis, is a potential antiviral strategy against hepatitis C virus. (2015)
  • Author(s): Saito K, Shirasago Y, Suzuki T, Aizaki H, Hanada K, Wakita T, Nishijima M, Fukasawa M. Targeting cellular squalene synthase, an enzyme essential for cholesterol biosynthesis, is a potential antiviral strategy against hepatitis C virus.
  • Journal Title: J Virol. Volume: 89 Pages: 2220-32
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Prolactin regulatory element binding protein and Surfeit 4 are involved in hepatitis C virus replication compartment by interacting with NS4B. (2016)
  • Author(s): Kong L, Fujimoto A, Nakamura M, Aoyagi H, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Arita M, Yamagoe S, Dohmae N, Suzuki T, Sakamaki Y, Ichinose S, Suzuki T, Wakita T, Aizaki H.
  • Organizer: Asian Pacific Association for the Study of the Liver
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2016-02-20 – 2016-02-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 感染細胞の超微形態変化（SVR 後も含めて） (2016)
  • Author(s): 相崎英樹
  • Organizer: (公財)宮川庚子記念研究財団研修会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2016-02-13 – 2016-02-13
  • Invited
• [Presentation] 肝炎ウイルス検査陽性者アンケート調査の受診勧奨効果 (2015)
  • Author(s): 中野卓二、橋本千樹、川部直人、村尾道人、嶋崎宏明、菅敏樹、中岡和徳、高川友花、大城昌史、高村知希、野村小百合、吉岡健太郎、中田佳穂里、青山政美、片岡博喜、相崎英樹、是永匡紹.
  • Organizer: 第41回日本肝臓学会西部会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2015-12-03 – 2015-12-04
• [Presentation] Development of a novel vaccine platform based on Japanese encephalitis viruses. (2015)
  • Author(s): Suzuki R, Saga R, Fujimoto A, Watanabe N, Matsuda M, Hasegawa M, Watashi K, Aizaki H, Nakamura N, Konishi E, Kato T, Tajima S, Takasaki T, Takeyama H, Wakita T.
  • Organizer: 日本分子生物学会第38回年会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Surfeit 4 is involved in HCV replication by interacting with NS4B. (2015)
  • Author(s): Lingbao K, Aoyagi H, Matsuda M, Fujimoto A, Watashi K, Suzuki R, Yamagoe S, Dohmae N, Sakamaki Y, Ichinose S, Suzuki T, Wakita T, Aizaki H.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第63回学術集会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] A new fungi-derived vanitaracin A specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses through interacting with NTCP. (2015)
  • Author(s): Kaneko M, Watashi K, Kamisuki S, Matsunaga H, Iwamoto M, Kawai H, Ohashi H, Tsukuda S, Shimura S, Suzuki R, Aizaki H, Sugiyama M, Sam-Yong P, Ohtani N, Sugawara F, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第63回学術集会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] Transfer Hepatitis C virus from human liver cells to hepatic stellate cells. (2015)
  • Author(s): Zaitsu T, Aoyagi H, Fujimoto A, Matsuda M, Watanabe N, Watashi K, Suzuki R, Fukuhara T, Matsuura Y, Sakamaki Y, Ichinose S, Wake K, Suzuki T, Iijima H, Matsuura T, Tamura K, Wakita T, Aizaki H.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第63回学術集会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] Multimerization of hepatitis B virus core protein regulated by microtubules. (2015)
  • Author(s): Iwamoto M, Watashi K, Sugiyama M, Suzuki R, Aizaki H, Tanaka Y, Mizokami M, Ohtani N, Koiwai O, Wakita T.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第63回学術集会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] Identification of a flavonoid derivative that directly acts on hepatitis B virus surface protein and inhibits viral entry. (2015)
  • Author(s): Tsukuda S, Watashi K, Hamada Y, Isogawa M, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Saito A, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第63回学術集会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] Bivalent vaccine platform based on Japanese encephalitis virus (JEV) elicit neutralizing antibodies against JEV and Hepatitis C virus. (2015)
  • Author(s): Saga R, Fujimoto A, Watanabe N, Matsuda M, Hasegawa M, Watashi K, Aizaki H, Nakamura N, Konishi E, Kato T, Tajima S, Takasaki T, Takeyama H, Wakita T, Suzuki R.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第63回学術集会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] Flutamide-mediated Disruption of Lipid Droplets Impairs the Host Permissiveness to Hepatitis C virus Production. (2015)
  • Author(s): Ohashi H, Watashi K, Nakajima S, Sulyi K, Suzuki R, Aizaki H, Fukasawa M, Kamisuki S, Sugawara F, Ohtani N, Wakita T.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第63回学術集会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] Transfer hepatitis C virus between human liver cells and hepatic stellate cells. (2015)
  • Author(s): Aizaki H.
  • Organizer: The 2015 Italy-Japan Liver Workshop
  • Place of Presentation: Italy
  • Year and Date: 2015-10-26 – 2015-10-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Japanese encephalitis virus (JEV)-subviral particles harboring HCV neutralization epitopes elicit neutralizing antibodies against JEV and HCV. (2015)
  • Author(s): Saga R, Fujimoto A, Watanabe N, Matsuda M, Hasegawa M, Watashi K, Aizaki H, Nakamura N, Konishi E, Kato T, Takeyama H, Wakita T, Suzuki R.
  • Organizer: 22nd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses.
  • Place of Presentation: Strasbourg, France
  • Year and Date: 2015-10-09 – 2015-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Prolactin regulatory element binding protein promotes the formation of HCV membranes replication compartment by interacting with NS4B. (2015)
  • Author(s): Kong L, Fujimoto A, Aoyagi H, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Yamagoe S, Dohmae N, Suzuki T, Suzuki T, Wakita T, Aizaki H.
  • Organizer: 22nd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses.
  • Place of Presentation: Strasbourg, France
  • Year and Date: 2015-10-04 – 2015-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of NTCP-targeting small molecules that inhibit HBV entry by cell-based and in vitro technologies. (2015)
  • Author(s): Watashi K, Tsukuda S, Shimura S, Kaneko M, Sluder A, Peel M, Kamisuki S, Matsunaga S, Morishita R, Futamura Y, Kondoh Y, Suzuki R, Aizaki H, Sugiyama M, Borroto-Esoda K, Ryo A, Sugawara F, Osada H, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T.
  • Organizer: 2015 International Meeting, Molecular Biology of Hepatitis B Viruses.
  • Place of Presentation: Dolce Bad Nauheim, Germany
  • Year and Date: 2015-10-04 – 2015-10-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cilnidipine inhibits the early phase of HBV infection in a NTCP independent mechanism. (2015)
  • Author(s): Tsukuda S, Watashi K, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Tanaka Y, Wakita T.
  • Organizer: 2015 International Meeting, Molecular Biology of Hepatitis B Viruses.
  • Place of Presentation: Dolce Bad Nauheim, Germany
  • Year and Date: 2015-10-04 – 2015-10-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of a new tricyclic polyketide, vanitaracin A, which inhibits the entry of HBV, HDV, and nucleoside analog-resistant HBV through targeting NTCP. (2015)
  • Author(s): Kaneko M, Watashi K, Kamisuki S, Mtsunaga H, Iwamoto M, Kawai F, Ohashi H, Tsukuda S, Shimura S, Suzuki R, Aizaki H, Sugiyama M, Sam-Yong P, Ohtani N, Sugawara F, Tanaka Y, Mizokami M, Sureau C, Wakita T.
  • Organizer: 2015 International Meeting, Molecular Biology of Hepatitis B Viruses.
  • Place of Presentation: Dolce Bad Nauheim, Germany
  • Year and Date: 2015-10-04 – 2015-10-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] B型肝炎ウイルスに対する直接標的薬proanthocyanidinおよび宿主標的薬vanitalacinの感染阻害効果および作用機序の解析. (2015)
  • Author(s): 渡士幸一、九十田千子、金子学、松永大輝、紙透伸治、齊藤安貴子、鈴木亮介、相崎英樹、杉山真也、溝上雅史、菅原二三男、田中靖人、脇田隆字.
  • Organizer: 第25回抗ウイルス療法学会総会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-05-22 – 2015-05-24
• [Presentation] Neoechinulin Bのliver X receptor転写阻害効果の同定およびそれによるC型肝炎ウイルス複製制御機構の解析. (2015)
  • Author(s): 渡士幸一、中嶋翔、紙透伸治、Jesus Izaguirre-Carbonell、Andrew Tae-Jun Kwon、鈴木治和、九十田千子、岡田麻衣子、鈴木亮介、相崎英樹、菅原二三男、脇田隆字
  • Organizer: 第25回抗ウイルス療法学会総会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-05-22 – 2015-05-24
• [Presentation] 新規真菌二次代謝産物 SF177 の B 型肝炎ウイルス感染阻害活性および NTCP トランスポーター阻害活性の同定. (2015)
  • Author(s): 金子学, 渡士幸一，紙透伸治, 岩本将士，河合文啓, 鈴木亮介，相崎英樹，朴三用, 菅原二三男, 脇田隆字.
  • Organizer: 第25回抗ウイルス療法学会総会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-05-22 – 2015-05-24
• [Presentation] HCV複製複合体を含む膜小胞の形成メカニズムの解析 (2015)
  • Author(s): 相崎英樹、脇田隆字.
  • Organizer: 第51回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 熊本
  • Year and Date: 2015-05-21 – 2015-05-22
• [Book] 肝炎ウイルス検査のすすめ (2016)
  • Author(s): 相崎英樹、脇田隆字
  • Total Pages: 2
  • Publisher: 国民生活センター
• [Book] C型肝炎ウイルスの複製・増殖のメカニズム、特集C型肝炎治療における新時代の幕開け、特集C型肝炎治療における新時代の幕開け (2015)
  • Author(s): 相崎英樹、脇田隆字
  • Total Pages: 4
  • Publisher: 医薬ジャーナル社
• [Book] 日本におけるC型肝炎の疫学国際比較、真ウイルス性肝炎学―最新の基礎・臨床研究情報― (2015)
  • Author(s): 田中純子、相崎英樹、内田茂治
  • Total Pages: 9
  • Publisher: 日本臨床社