複製複合体を含む膜小胞でのC型肝炎ウイルスの複製メカニズムの解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09034
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 相崎 英樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (00333360)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: C型肝炎ウイルス / 複製 / 宿主因子 / 小胞輸送

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的はC型肝炎ウイルス（HCV）の複製に関与する宿主因子を見い出し、ウイルス複製のメカニズムを明らかにすることである。プラス鎖RNAウイルスは複製複合体を含む膜小胞(Double membrane vesicle)を形成し、その中で複製複合体を形成し、複製することが知られている。昨年度までにHCV複製に関与する膜小胞(Double membrane vesicle)の形成に重要な役割を果たしているNS4Bと結合する膜タンパクとして小胞輸送（メンブレントラフィック）に関与するERタンパク（COPII）、Golgiタンパク（COPI）を見出した。そこで、本年度はメンブレントラフィックがHCV増殖に関与している可能性を考えて、COPIIおよびCOPI関連タンパクSec23, Sec24, Sec13, Sec31, SAR1, Sec16, RAB1, CSNK1のsiRNAをレプリコン細胞に導入しウイルス複製に与える影響を調べたところ、Sec31 siRNAがウイルス複製を抑制した。SEC31のshRNAレンチウイルスを使って、FVC細胞に感染し、SEC31-KO細胞株を作成した。MOI１でJFH1株を感染させ、ウイルスの感染増殖は強く抑制されたことから、ウイルスの生活環に関わる新規宿主因子としてSec31が見出された。小胞輸送（メンブレントラフィック）は細胞の恒常性維持に重要な役割を果たしていると考えられ、HCVはその一部を利用することで、その生活環（感染、翻訳、ゲノム合成、粒子形成、放出）を行っているものと考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

HCVの生活環に関与する新規宿主因子Sce31を見出し、概ね順調に進展していると言える。
プラス鎖RNAウイルスは複製複合体を含む膜小胞(Double membrane vesicle)を形成し、その中で複製複合体を形成し、複製することが知られている。本研究ではHCVの複製のメカニズム解析を目指ている。HCVNS4BはHCV複製に関与するDouble membrane vesicleの形成に重要な役割を果たしていることが知られているので、NS4Bと結合する膜タンパクを同定し、そのタンパクの複製における役割について解析した。我々はこれまでに、プロテオーム解析およびsiRNAスクリーニングにて、NS4B結合膜タンパクとしてprolactin regulatory element binding protein (PREB)およびSurfeit 4 (SURF4)を見出した。PREBおよびSURF4はそれぞれSec12、ERV29とも呼ばれ、COPII、COPIを介した小胞輸送（メンブレントラフィック）に関与するタンパクとして知られている。このことから小胞輸送がHCV複製複合体を含む膜小胞の形成に重要な役割を果たしている可能性が考えられたので、COPIIおよびCOPI関連タンパクのHCV複製における役割を解析した。そしてHCV増殖に関与するタンパクとしてCOPII関連タンパクのSec31を新たに見出した。

Strategy for Future Research Activity

Sec31がHCV生活環のどのステップに関与しているか、ウイルス感染（HCV擬似ウイルスシステム）、ゲノム複製（レプリコンシステム）、その他のステップ（HCVJFH1システム）を用いて縛りこむ。特にゲノム複製については、翻訳とRNA合成の２つのステップに分けて解析を進める。

Causes of Carryover

Sec31がHCV生活環のどのステップに関与しているか、ウイルス感染（HCV擬似ウイルスシステム）、ゲノム複製（レプリコンシステム）、その他のステップ（HCVJFH1システム）を用いて縛りこむ。特にゲノム複製については、翻訳とRNA合成の２つのステップに分けて解析を進める。

Expenditure Plan for Carryover Budget

Sec31KO細胞樹立に時間がかかったため、Sec31KO細胞を用いた実験に使用予定だった研究費に余裕ができた。

Research Products

• [Journal Article] Human Cathelicidin Compensates for the Role of Apolipoproteins in Hepatitis C Virus Infectious Particle Formation. (2016)
  • Author(s): Puig-Basagoiti F, Fukuhara T, Tamura T, Ono C, Uemura K, Kawachi Y, Yamamoto S, Mori H, Kurihara T, Okamoto T, Aizaki H, Matsuura Y.
  • Journal Title: J Virol. Volume: 90(19) Pages: 8464-77
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Bivalent vaccine platform based on Japanese encephalitis virus (JEV) elicits neutralizing antibodies against JEV and hepatitis C virus. (2016)
  • Author(s): Saga R, Fujimoto A, Watanabe N, Matsuda M, Hasegawa M, Watashi K, Aizaki H, Nakamura N, Tajima S, Takasaki T, Konishi E, Kato T, Kohara M, Takeyama H, Wakita T, Suzuki R.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 27 Pages: 28688
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Single-domain intrabodies against HCV Core inhibit viral propagation and Core-induced NF-κB Activation. (2016)
  • Author(s): Suzuki R, Saito K, Matsuda M, Sato M, Kanegae Y, Shi G, Watashi K, Aizaki H, Chiba J, Saito I, Wakita T, Suzuki T.
  • Journal Title: J Gen Virol. Volume: 97(4) Pages: 887-92
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Prolactin regulatory element binding protein is involved in hepatitis C virus replication compartment by interacting with NS4B. (2016)
  • Author(s): Kong L, Fujimoto A, Nakamura M, Aoyagi H, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Arita M, Yamagoe S, Dohmae N, Suzuki T, Sakamaki Y, Ichinose S, Suzuki T, Wakita T, Aizaki H.
  • Journal Title: J Virol. Volume: 90(6) Pages: 3093-111
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Ultrastructure of hepatocytes in chronic hepatitis C patients who achieve a sustained virological response. (2017)
  • Author(s): Aoyagi H, Iijima H, Puig-Basagoiti F, Zheng X, Kao YT, Hossam GE, Zaitsu T, Matsuda M, Watashi K, Suzuki S, Masaki T, Shimada N, Kato K, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Wake K, Wakita T, Aizaki H.
  • Organizer: The Asian Pacific Association for the Study of the Liver
  • Place of Presentation: China
  • Year and Date: 2017-02-16 – 2017-02-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] HCVに対する抗ウイルス治療後、SVR後の肝細胞の超微細構造の変化 (2016)
  • Author(s): 青柳東代、飯島尋子、松田麻未、渡士幸一、鈴木亮介、會澤信弘、政木隆博、坪田昭人、和氣健二郎、脇田隆字、相崎英樹
  • Organizer: 第41回日本肝臓学会東部会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2016-12-08 – 2016-12-09
• [Presentation] Aryl hydrocarbon receptor regulates the assembly of hepatitis C virus and affects the emergence of drug resistant virus against DAAs. (2016)
  • Author(s): Ohashi H, Nakajima S, Kim S, Suzuki R, Aizaki H, Fukasawa M, Kamisuki S, Sugawara F, Ohtani N, Wakita T, Watashi K.
  • Organizer: 日本ウイルス学会第64回学術集会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2016-10-23 – 2016-10-25
• [Presentation] Sphingomyelin is a component in the membranous replication factories. (2016)
  • Author(s): Gewaid HE, Aoyagi H, Watashi K, Suzuki R, Aly H, Kumagai K, Yamaji T, Fukasawa M, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Hanada K, Wakita T, Aizaki H.
  • Organizer: 23rd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses.
  • Place of Presentation: Japan
  • Year and Date: 2016-10-11 – 2016-10-15
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Human hepatic stellate cells are permissive for hepatitis C virus infection/replication and play important roles in fibrosis. (2016)
  • Author(s): Zaitsu T, Aoyagi H, Matsuda M, Watanabe N, Fujimoto A, Watashi K, Suzuki R, Fukuhara T, Matsuura Y, Wake K, Suzuki T, Matsuura T, Tamura K, Wakita T, Aizaki H.
  • Organizer: 23rd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses. Kyoto
  • Place of Presentation: Japan
  • Year and Date: 2016-10-11 – 2016-10-15
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Activation of protein kinase R by hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase. (2016)
  • Author(s): Suzuki R, Matsuda M, Shimoike T, Watashi K, Aizaki H, Kato T, Suzuki T, Wakita T.
  • Organizer: 23rd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses.
  • Place of Presentation: Japan
  • Year and Date: 2016-10-11 – 2016-10-15
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Role of lipid droplets in the emergence of drug resistant virus against direct acting antivirals. (2016)
  • Author(s): Ohashi H, Nakajima S, Kim S, Suzuki R, Aizaki H, Fukasawa M, Kamisuki S, Sugawara F, Ohtani N, Wakita T, Watashi K.
  • Organizer: 23rd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses.
  • Place of Presentation: Japan
  • Year and Date: 2016-10-11 – 2016-10-15
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Ultrastructure of hepatocytes in chronic hepatitis C patients who achieve a sustained virological response. (2016)
  • Author(s): Aoyagi H, Iijima H, Puig-Basagoiti F, Zheng X, Kao YT,. Hossam GE, Zaitsu T, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Masaki T, Shimada N, Kato K, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Wake K, Wakita T, Aizaki H.
  • Organizer: The 15th Awaji International Forum on Infection and Immunity.
  • Place of Presentation: Japan
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-09
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] HCVに対する抗ウイルス治療後、SVR後の肝細胞の超微細構造の変化 (2016)
  • Author(s): 青柳東代、飯島尋子、松田麻未、渡士幸一、鈴木亮介、政木隆博、三又絢子、酒巻有里子、市野瀬志津子、坪田昭人、和氣健二郎、脇田隆字、相崎英樹
  • Organizer: 広島肝臓プロジェクト研究センターシンポジウム
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2016-06-25 – 2016-06-25
• [Presentation] スフィンゴ脂質のC型肝炎ウイルス複製における役割の解析. (2016)
  • Author(s): ホッサムゲワイド、口頭、青柳東代、渡士幸一、鈴木亮介、熊谷圭悟、山地俊之、深澤征義、酒巻有里子、市野瀬志津子、花田賢太郎、脇田隆字、相崎英樹.
  • Organizer: 第５８回日本脂質生化学学会
  • Place of Presentation: 秋田
  • Year and Date: 2016-06-09 – 2016-06-10
• [Presentation] HCVに対する抗ウイルス治療後、SVR後の肝細胞の超微細構造の変化. (2016)
  • Author(s): 青柳東代、飯島尋子、松田麻未、渡士幸一、鈴木亮介、政木隆博、坂巻有里子、市野瀬志津子、坪田昭人、和氣健二郎、脇田隆字、相崎英樹
  • Organizer: 第26回抗ウイルス療法学会総会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2016-05-13 – 2016-05-15
• [Presentation] Surfeit 4 is involved in HCV replication by interacting with NS4B. Positive-strand RNA viruses (2016)
  • Author(s): Kong L, Aoyagi H, Matsuda M, Fujimoto A, Watashi K, Suzuki R, Suzuki T, Wakita T, Aizaki1 H,
  • Organizer: Plus strand RNA meeting
  • Place of Presentation: USA
  • Year and Date: 2016-05-02 – 2016-05-05
  • Int'l Joint Research
• [Book] Mebio (2017)
  • Author(s): 相崎英樹、和気健二郎、脇田隆字
  • Total Pages: 10
  • Publisher: メジカルビュー社
• [Book] 医薬ジャーナル (2016)
  • Author(s): 相崎英樹、脇田隆字
  • Total Pages: 4
  • Publisher: 医薬ジャーナル社
• [Book] くらしの豆知識 (2016)
  • Author(s): 相崎英樹、脇田隆字
  • Total Pages: 2
  • Publisher: 国民生活センター