2017 Fiscal Year Research-status Report
複製複合体を含む膜小胞でのC型肝炎ウイルスの複製メカニズムの解析
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15K09034
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
相崎 英樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (00333360)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | HCV / DMV / Surf4 / Replication / プラス鎖RNAウイルス / 複製複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
C型肝炎ウイルス(HCV)、ポリオウイルス、サーズコロナウイルス等のプラス鎖RNAウイルスは複製複合体を含む膜小胞(Double membrane vesicle(DMV))を形成し、その中で複製複合体を形成し、複製することが知られている。本研究ではHCVの複製メカニズム解析を目指す。HCVNS4BはHCV複製に関与するDMVの形成に重要な役割を果たしていることが知られているので、NS4Bと結合する膜タンパクを同定し、そのタンパクの複製における役割について解析した。
我々はこれまでに、プロテオーム解析およびsiRNAスクリーニングにて、NS4B結合膜タンパクとしてSurfeit 4 (Surf4)を見出した。SURF4はCOPIを介した小胞輸送（メンブレントラフィック）に関与するタンパクとして知られている。Surf4はHCV RNA複製複合体が存在する脂質ラフト膜で検出され、レプリコン細胞内のウイルスdsRNAと共局在した。しかしながら、NS4Bに結合する能力を欠くSurf4d1は、dsRNAと共存しなかった。全長Surf4の発現によりHCV複製が増加し、一方Surf4d1では変化なかったことから、Surf4とNS4Bとの相互作用が複製に重要であることを示した。電顕観察でSurf4 siRNA処理細胞ではDMVの数が大きく減少していた。
ポリオウイルスレプリコンをsiRNAで処理すると複製が減少し、デングウイルスでは減少しなかった。ポリオウイルスはDMVを形成し複製することが知られている、一方デングウイルスではDMVを形成しないことから、Surf4はHCV、ポリオウイルス、サーズコロナウイルス等のプラス鎖RNAウイルスに共通の複製コンポーネント形成に作用する可能性が示された。
以上の結果から、NS4Bと相互作用することによってSurf4がHCV RNA複製複合体に動員され、DMVの形成を増加させることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず、NS4BとSurf4の結合を免疫沈降法、蛍光染色法、proximity ligation assay(PLA)法で確認した。Huh7細胞にNS4BとSurf4を発現させると、NS4BとSurf4は共沈し、共局在し、２つのタンパクが近接すると発光するPLA法で陽性所見が得られた。Sryf4の各種欠損体を作成したところ、C末欠損Sruf4はNS4Bに結合せず、蛍光染色法で共局在せず、PLA法で陰性であった。Surf4の発現を抑制したHuh7細胞にレプリコンを導入しても複製は少ないが、全長のSurf4を発現させると発現は回復したものの、C末欠損Sruf4では回復が見られなかった。Surf4とNS4Bの結合がHCVの複製に重要なことが示された。さらに、Surf4 siRNA処理細胞の電顕観察ではDMVの数が大きく減少していた。ウイルス複製の減少に伴ってDMVが減少している可能性も考えられるため、Huh7細胞に安定的に大量のNS5Bの複製活性がないNSタンパクを発現する実験系を作成し、この細胞内での観察されるDMVにSurf4 siRNAの与える影響を調べた。HCVの複製に依存しないDMV産生系にSurf4 siRNAを導入したところ、DMVの数が減少したことから、Surf4はDMV形成に重要なことが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
ウイルス複製の減少に伴ってDMVが減少している可能性も考えられるため、Huh7細胞に安定的に大量のNS5Bの複製活性がないNSタンパクを発現する実験系を作成し、この細胞内での観察されるDMVにSurf4 siRNAの与える影響を電顕で調べる。さらに、HCVレプリコン細胞からDMVを抽出し、その性質について解析を進める。脂質ラフト膜に包まれていることから、界面活性剤不溶性の可能性がある。さらに、HCV複製複合体はこの膜小胞内に包まれているものと考えられることから、RNase耐性、Protease耐性であることが期待される。このような膜の性質について解析を進める。
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| Causes of Carryover |
目的のタンパクのウイルス増殖に与える影響を調べるため、細胞で強制発現を試みたものの 十分な発現量が得られなかった。そこで抗生剤耐性遺伝子で発現細胞を選択するシステムを導入することになり、恒常的に発現する細胞株を得ることができた。安定発現株の取得に時間を要したため、次年度使用額が生じた。
ウイルス複製に依存しないDMV産生実験系を作成し、この細胞内での観察されるDMVにSurf4 siRNAの与える影響を電顕で調べる。さらに、HCVレプリコン細胞からDMVを抽出し、その性質について解析を進める。脂質ラフト膜に包まれていることから、界面活性剤不溶性の可能性がある。さらに、HCV複製複合体はこの膜小胞内に包まれているものと考えられることから、RNase耐性、Protease耐性であることが期待される。このような膜の性質について解析を進める。
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Research Products
(19 results)
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[Presentation] Generation of hepatitis C virus vaccine antigen based on Japanese encephalitis virus subviral particles.2017
Author(s)
Yato K, Matsuda M, Watanabe N, Nakajima S, Fujimoto A, Watashi K, Aizaki H, Kato T, Tamura K, Wakita T, Suzuki R.
Organizer
日本ウイルス学会第65回学術集会
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[Presentation] Membrane protein, embryonic lethal, abnormal vision, drosophila-like 1, interacts with NS5A and involves in hepatitis C virus replication2017
Author(s)
Kao YT, Goto K, Aoyagi H, Hossam GE, Zheng X, Puig-Basagoiti F, Watashi K, Suzuki R, Yamagoe S, Dohmae N, Suzuki T, Okushin K, Tsutsumi T, Yotsuyanagi H, Moriya K, Koike K, Suzuki T, Wakita T, Aizaki H
Organizer
日本ウイルス学会第65回学術集会
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[Presentation] Human hepatic stellate cells are permissive for hepatitis C virus infection/replication and play important roles in fibrosis2017
Author(s)
Zheng X, Zaitsu T, Aoyagi H, Matsuda M, Watanabe N, Fujimoto A, Watashi K, Suzuki R, Fukuhara T, Matsuura Y, Ichinose S, Wake K, Suzuki T, Iijima H, Yokoyama H, Masaki T, Matsuura T, Tamura K, Wakita T, Aizaki H
Organizer
日本ウイルス学会第65回学術集会
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[Presentation] Abnormal hepatocellular organelles remain to be observed in sustained virological response patients2017
Author(s)
Aoyagi H, Iijima H, Puig-Basagoiti F, Zheng X, Kao YT, Hossam GE, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Masaki T, Aizawa N, Shimada N, Kato K, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Wake K, Wakita T, Aizaki H
Organizer
日本ウイルス学会第65回学術集会
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[Presentation] C型慢性肝炎のウイルス学的著効（SVR）後の肝実質細胞のオルガネラ異常の解析2017
Author(s)
青柳東代, 飯島尋子, Francesc Puig-Basagoiti, Zheng Xin, Yu Ting Kao, Gewaid E. Hossam, 在津拓馬, 松田麻未, 渡士幸一, 鈴木亮介, 政木隆博, 島田紀明, 加藤慶三, 坪田昭人, 三又絢子, 酒巻有里子, 市野瀬志津子, 和氣健二郎, 脇田隆字, 相崎英樹
Organizer
第27回抗ウイルス療法学会学術集会・総会
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[Presentation] Crosstalk of Xenobiotic Metabolism Pathway with Lipid Metabolism regulates the Host Permissiveness to Hepatitis C Virus Production2017
Author(s)
Ohashi H, Nakajima S, Kim S, Suzuki R, Aizaki H, Fukasawa M, Kamisuki S, Sugawara F, Ohtani N, Wakita T, Watashi K
Organizer
第14回ウイルス学キャンプin湯河原
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[Presentation] Abnormal organelles were continuously observed in sustained virological response (SVR) patients2017
Author(s)
Aoyagi H, Iijima H, Puig-Basagoiti F, Zheng X, Kao YT, Gewaid HE, Zaitsu T, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Masaki T, Shimada N, Kato K, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Wake K, Wakita T, Aizaki H
Organizer
The Asian Pacific Associaton for the Study of the Liver - Single Topic Conference 2017
Int'l Joint Research
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[Presentation] Sphingomyelin participates in the formation of Hepatitis C virus membrane replication vesicles2017
Author(s)
Gewaid HE, Aoyagi H, Arita M, Watashi K, Suzuki R, Aly HH, Kumagai K, Yamaji T, Fukasawa M, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Hanada K, Wakita T, Aizaki H
Organizer
American Society for Virology - 2017 Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] NS5A-Associated Membrane Protein, Embryonic Lethal, Abnormal Vision, Drosophila-Like 1, Involves in Hepatitis C Replication2017
Author(s)
Kao YT, Goto K, Aoyagi H, Hossam GE, Zheng X, Puig-Basagoiti F, Watashi K, Suzuki R, Yamagoe S, Dohmae N, Suzuki T, Okushin K, Tsutsumi T, Yotsuyanagi H, Moriya K, Koike K, Suzuki T, Wakita T, Aizaki H
Organizer
24th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
Int'l Joint Research
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[Presentation] Novel Crosstalk of Xenobiotic Response with Lipid Metabolism Regulates the Host Permissivenessto Hepatitis C Virus Production2017
Author(s)
Ohashi H, Nakajima S, Kim S, Suzuki R, Aizaki H, Fukasawa M, Kamisuki S, Sugawara F, Ohtani N, Wakita T, Watashi K
Organizer
24th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
Int'l Joint Research
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[Presentation] Sphingomyelin participates in the formation of Hepatitis C virus membrane replication vesicles.2017
Author(s)
Gewaid HE, Aoyagi H, Kao YU, Zheng X, Puig-Basagoiti F, Watashi K, Arita M, Suzuki R, Aly HH, Kumagai K, Yamaji T, Fukasawa M, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Hanada K, Wakita T, Aizaki H
Organizer
24th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
Int'l Joint Research
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