関節リウマチの新しい予防・治療法確立への挑戦

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09522
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 小澤 龍彦 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (10432105)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 関節リウマチ / ACAP / CCP / シトルリン化タンパク質 / モノクローナル抗体

Outline of Annual Research Achievements

天然アミノ酸であるシトルリンを含む環状ペプチド(cyclic citrullinated peptide; CCP)に対する抗体(anti-citrullinated protein antibodies; ACPA) は、関節リウマチ(RA)患者に特異的に出現する自己抗体である。その自己抗原を同定することでACPAの誘導メカニズムやRAとの病態を考察する研究が進められている。本研究では、我々が単離したシトルリン化ペプチドcfc1-cyc と結合するRA患者由来モノクローナルACPA(CCP-Ab1)を用いて、その抗原の同定を進めた。
平成27年度は、細菌、ウイルスなどの外来抗原のタンパク質をCCP-Ab1がエピトープとするアミノ酸配列を用いて相同性検索により、3,000種類以上の候補タンパク質を同定した。これらタンパク質の幾つかをin vitroで合成してウエスタンにより結合性を確認したところ、いずれもシトルリン化処理特異的に結合する事が示された。またCCP-Ab1と結合する生体内のネイティブタンパク質を同定するために、血漿をBlue Native PAGEにより分離し、ウエスタンを行った結果、高分子量領域において結合するタンパク質が確認された。CCP-Ab1と抗原であるcfc1-cycとの結合様式をX線結晶構造解析にて明らかにするために、CCP-Ab1のFab化抗体の大量調整を行っている。またin vivoモデルを構築するため、抗体の大量調整を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初は平成28年度までにと予定していたCCP-Ab1 と結合する細菌、ウイルス、植物タンパク質の同定は順調に進み、予定を前倒しして行い、複数のタンパク質を同定するに至った。
CCP-Ab1 と結合する生体内のネイティブなタンパク質の同定は予定通り進み、血漿中に存在するネイティブなタンパク質とCCP-Ab1が結合することが示された。X線結晶構造解析に必要なFab化タンパク質、及びマウスに投与するための調整に手間取っているが、安定発現株を樹立する事で高発現ができる予備的結果が得られた。
平成27年度中に、平成28年度以降で予定している実験の基盤を構築する予定としていたが、その基盤が概ねできたことから達成度を、おおむね順調に進展している、とした。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度までに、CCP-Ab1と結合するネイティブタンパク質の存在が確認されたため、このタンパク質の同定を行う。具体的には血漿をゲル濾過、アフィニティー精製、二次元電気泳動などで目的タンパク質を分離し、質量分析により候補を絞り込む。その後候補のリコンビナントタンパク質を作成もしくは入手し、CCP-Ab1と確かに結合するかを検証する。
X線結晶構造解析に必要なFab化抗体は10mg以上と非常に多い。またマウスに投与するCCP-Ab1の必要量も数mg以上と多い。現状CCP-Ab1の産生は一過性の発現系を用いているが、産生量が低くこの系では費用がかさむため、CCP-Ab1を産生する安定発現株の樹立を行う。

Causes of Carryover

平成27年度に予定していた実験が順調に進んだため、予定していた額よりも少なく済ませることができた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度には抗体の大量調整を予定しており、これに多くの費用が必要と想定している。そのため平成27年度からの繰越金を、この抗体の大量調整に充てる事を予定している。

Research Products

• [Journal Article] A Human Anti-M2 Antibody Mediates Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) and Cytokine Secretion by Resting and Cytokine-Preactivated Natural Killer (NK) Cells (2015)
  • Author(s): Venkateswara R. Simhadri, Milena Dimitrova, John L. Mariano, Olatz Zenarruzabeitia, Weimin Zhong, Tatsuhiko Ozawa, Atsushi Muraguchi, Hiroyuki Kishi, Maryna C. Eichelberger, Francisco Borrego
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0124677
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0124677
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay (2015)
  • Author(s): Hiroyuki Takeda, Tomio Ogasawara, Tatsuhiko Ozawa, Atsushi Muraguchi, Pei-Ju Jih, Ryo Morishita, Motokazu Uchigashima, Masahiko Watanabe, Toyoshi Fujimoto, Takahiro Iwasaki, Yaeta Endo, Tatsuya Sawasaki
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 5 Pages: 11333
  • DOI: 10.1038/srep11333
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Monoclonal Antibody Against Citrullinated Peptides Obtained From Rheumatoid Arthritis Patients Reacts With Numerous Citrullinated Microbial and Food Proteins (2015)
  • Author(s): Reina Tsuda, Tatsuhiko Ozawa, Eiji Kobayashi, Hiroshi Hamana, Hirofumi Taki, Kazuyuki Tobe, Eiji Sugiyama, Masahiro Iwamoto, Johji Imura, Hiroyuki Kishi, Atsushi Muraguchi
  • Journal Title: Arthritis & Rheumatology Volume: 67 Pages: 2020-2031
  • DOI: 10.1002/art.39161
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] ISAAC法を用いた関節リウマチ患者由来自己抗体の単離とその自己抗体が認識する新しい自己抗原の同定 (2015)
  • Author(s): 小澤龍彦、津田玲奈、浜名洋、多喜博文、戸邊一之、杉山英二、岩本雅弘、井村穣二、岸裕幸、村口篤
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県、神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 抗膜タンパク質ウサギ高親和性モノクローナル抗体のエピトープ配列を由来とする新規アフィニティタグの開発 (2015)
  • Author(s): 矢野智也、竹田浩之、小澤龍彦、村口篤、澤崎達也
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県、神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] コムギ無細胞系を用いた膜タンパク質間トランス相互作用解析技術 (2015)
  • Author(s): 栄谷紘一、竹田浩之、小澤龍彦、村口篤、澤崎達也
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県、神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ERKを介したErbB2 Thr-677リン酸化によるErbB2/ErbB3ヘテロ二量体のフィードバック阻害機構 (2015)
  • Author(s): 河崎優希、崎村綾香、Chulmin Park、周越、都丸里佳、成田香織、小澤龍彦、村口篤、櫻井宏明
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県、神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ISAAC 法による日本脳炎ワクチン被接種者末梢血単核球からのヒト抗ウエストナイルウイルス中和モノクローナル抗体の樹立 (2015)
  • Author(s): Masaki, H., Ozawa, T., Takahashi, T., Aoyama, I. Yumisashi, T.,Konishi, E., Kishi, H., Muraguchi, A.
  • Organizer: 第63回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県、福岡市）
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] ＩＳＡＡＣ法による日本脳炎ワクチン被接種者末梢血単核球からのヒト抗ウエストナイルウイルス中和モノクローナル抗体の樹立（第２報） (2015)
  • Author(s): 正木秀幸、小澤龍彦、高崎智彦、青山幾子、弓指孝博、小西英二、岸裕幸、村口篤
  • Organizer: 第22回トガ・フラビ・ペスチウイルス研究会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県、福岡市）
  • Year and Date: 2015-11-21
• [Presentation] Reactivity of a monoclonal anti-citrullinated protein antibody obtained from RA patient with numerous citrullinated antigens (2015)
  • Author(s): Ozawa, T., Tsuda, R., Hamana, H., Taki, H., Kishi, H., Muraguchi, A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道、札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Identification of tumor-specific T cell receptors from primary tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) obtained from B16F10 melanoma-bearing mice (2015)
  • Author(s): Shitaoka, K., Kishi, H., Hamana, H. Ozawa, T. Muraguchi, A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道、札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] TRAIL Receptor-1 IgM Antibodies Strongly Induced Apoptosis in Cancer Cells (2015)
  • Author(s): Piao, X., Ozawa, T., Kishi, H., Shitaoka, K., Hamana, H., Muraguchi, A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道、札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Obtaining monoclonal TRIM21/Ro52 autoantibodies from collagen diseases patients with interstitial lung disease and reactivity of peptide library with these monoclonal autoantibodies. (2015)
  • Author(s): Obi, M. Ozawa, T. Taki, H. Kishi, H. Muraguchi, A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道、札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Establishment of West Nile virus-neutralizing human monoclonal antibodies derived from the individuals vaccinated with inactivated Japanese encephalitis virus by ISAAC technology (2nd.) (2015)
  • Author(s): Masaki, H. Ozawa, T. Takahashi, T. Kishi, H. Muraguchi, A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道、札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Development of a NFAT-luciferase reporter system for screening of antigen-specific TCRs using non-T cells (2015)
  • Author(s): Hamana, H. Kishi, H. Shitaoka, K. Piao, X. Ozawa, T. Muraguchi, A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道、札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] 乳がん細胞におけるErbB2 Thr-677 リン酸化によるErb2/ErbB3 ヘテロダイマーのフィードバック阻害機構 (2015)
  • Author(s): 河崎優希、崎村綾香、Chulmin Park、周越、都丸里佳、成田香織、小澤龍彦、村口篤、櫻井宏明
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県、名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10