関節リウマチの新しい予防・治療法確立への挑戦

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09522
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 小澤 龍彦 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (10432105)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: モノクローナルACPA / 関節リウマチ / シトルリン化 / ISAAC法

Outline of Annual Research Achievements

天然アミノ酸であるシトルリンを含む環状ペプチド(cyclic citrullinated peptide; CCP)に対する抗体(anti-citrullinated protein antibodies; ACPA) は、関節リウマチ(RA)患者に特異的に出現する自己抗体である。その自己抗原を同定することでACPAの誘導メカニズムやRAとの病態を考察する研究が進められている。本研究では、我々が単離したシトルリン化ペプチドcfc1-cyc と結合するRA患者由来モノクローナルACPA(CCP-Ab1)を用いて、その抗原の同定を進めた。
平成28年度は、平成27年度で見いだされたCCP-Ab1と結合する血漿中の高分子領域のタンパク質の同定を試みた。血漿をBlue Native PAGEにより分離し、目的分子量位置のゲルを切り出し、それを用いて質量分析を行った結果、多数のペプチドが同定され、幾つかの候補抗原が見いだされた。現在これら候補抗原の検証を行っている。
X線結晶構造解析に必要なFab化抗体は10mg以上と非常に多い。またマウスに投与するCCP-Ab1の必要量も数mg以上と多い。抗体作製の費用がかさむことから、CCP-Ab1の安定発現株を樹立し、抗体の大量調整を行うことを試みた。平成28年度中に、安定発現株を樹立することができ、抗体の大量調整基盤が整った。現在この細胞株を用いて、X線結晶構造解析に必要なFab化抗体、及びin vivo投与に必要な抗体の大量調整を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度中に予定してた、CCP-Ab1と結合するネイティブタンパク質の候補を見いだす事、共結晶化スクリーニング及びin vivo投与に必要な抗体の大量調整基盤を調える事のいずれも達することができた。これら基盤を元に、CCP-Ab1と結合するネイティブタンパク質の同定、X線結晶構造解析、及びin vivoモデル実験が行えるようになったため、おおむね順調に進展している、とした。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度までに、CCP-Ab1と結合するネイティブタンパク質の候補が見いだされたため、これらタンパク質の確認を行うと供に、候補タンパク質の同定を行う。具体的には、得られた候補のリコンビナントタンパク質を作製、もしくは入手し、CCP-Ab1と確かに結合するかを検証する。
X線結晶構造解析に必要なFab化抗体は10mg以上と非常に多い。またマウスに投与するCCP-Ab1の必要量も数mg以上と多い。平成28年度までにCCP-Ab1の安定発現株が樹立できたことから、抗体の大量調整基盤が整った。今後この細胞株を用いて抗体の大量調整を行い、CCP-Ab1と抗原ペプチドであるcfc1-cycとの共結晶化スクリーニング、及びin vivo投与を進めていく。

Causes of Carryover

抗体の大量調整には経費がかかる問題が存在していた。抗体作製の経費削減系を別の事業により試みた結果、想定以上に削減効果が得られる系が得られたため、本研究でも取り入れた。そのため想定していた経費よりも安く抑えることができた。また昨年度からの繰越金もあった事から、今年度も来年度へ繰り越す額が生じる結果となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

来年度の大きな実験系として、X線結晶構造解析を行うための結晶化スクリーニングを予定している。このスクリーニングには経費が削減できたとは言え、大量の抗体と膨大な数の結晶化条件を試す必要がある。これは経費がかかる実験系であり、これに充てる事を予定している。

Research Products

• [Journal Article] A novel, rapid and efficient method of cloning functional antigen-specific T-cell receptors from single human and mouse T-cells (2016)
  • Author(s): Hamana H, Shitaoka K, Kishi H, Ozawa T, Muraguchi A
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 474 Pages: 709-714
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.05.015
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TRAIL-receptor 1 IgM antibodies strongly induce apoptosis in human cancer cells in vitro and in vivo. (2016)
  • Author(s): Piao X, Ozawa T, Hamana H, Shitaoka K, Jin A, Kishi H, Muraguchi A.
  • Journal Title: Oncoimmunology Volume: 5 Pages: e1131380
  • DOI: 10.1080/2162402X.2015.1131380
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Feedback control of ErbB2 via ERK-mediated phosphorylation of a conserved threonine in the juxtamembrane domain. (2016)
  • Author(s): Kawasaki Y, Sakimura A, Park CM, Tomaru R, Tanaka T, Ozawa T, Zhou Y, Narita K, Kishi H, Muraguchi A, Sakurai H.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 6 Pages: 31502
  • DOI: 10.1038/srep31502
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fully human monoclonal antibodies to TRAIL-R1 enhance TRAIL-induced apoptosis via activation of caspase-8 pathway. (2016)
  • Author(s): Hao Z, Han X, Sun X, Shen M, Huang J, Li Y, Ozawa T, Pang D, Jin S, Kishi H, Muraguchi A, Jin A.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 475 Pages: 238-244
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.05.089
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] CR repertoire of CD4+CD25+CD137+Foxp3+ tumor infiltrating lymphocytes in mice. (2016)
  • Author(s): Kishi H, Hamana H, Shitaoka K, Lyu F, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター・ラグナガーデンホテル（沖縄県・宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [Presentation] ingle-T-cell manipulation method using microwell array chip (T-ISAAC) allows rapid and efficient cloning of antigen-specific TCRs. (2016)
  • Author(s): Ozawa T, Kishi H, Hamana H, Tajiri K, Muraguchi A.
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター・ラグナガーデンホテル（沖縄県・宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [Presentation] A rapid and easy system for cDNAs cloning of antigen specific TCRs from single human and mouse T-cells within 4 days. (2016)
  • Author(s): Hamana H, Kishi H, Shitaoka K, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター・ラグナガーデンホテル（沖縄県・宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [Presentation] T cell receptor obtained from tumor-infiltrating lymphocytes without using tumor-specific antigens exhibits cytotoxicity to tumors in vitro and in vivo. (2016)
  • Author(s): Shitaoka K, Kishi H, Hamana H, Hayakawa Y, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター・ラグナガーデンホテル（沖縄県・宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [Presentation] CR repertoire analysis of OVA-specific T-cells infiltrating into OVA-expressing-melanoma during tumor progression. (2016)
  • Author(s): Lyu F, Shitaoka K, Hamana H, Hayakawa Y, Kishi H, Muraguchi A
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター・ラグナガーデンホテル（沖縄県・宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [Presentation] Epitopes and tissue reactivity of monoclonal anti-TRIM21/Ro52 autoantibodies isolated from collagen disease-patients with interstitial lung disease. (2016)
  • Author(s): Okumura M, Ozawa T, Taki H, Kishi H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター・ラグナガーデンホテル（沖縄県・宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [Presentation] Peripheral myeloid dendritic cells may predict the prognosis of patients with hepatocellular carcinoma. (2016)
  • Author(s): Tajiri K, Ozawa T, Kishi H, Muraguchi A
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター・ラグナガーデンホテル（沖縄県・宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [Presentation] evelopment of novel human anti-HLA-monoclonal antibodies for clinical applications using peripheral blood B cells derived from anti-HLA antibody-positive donors. (2016)
  • Author(s): Takamatsu H, Zaimoku Y, Ozawa T, Kawai S, Tanaka H, Kishi H, Muraguchi A, Nakao S.
  • Organizer: 58th ASH Annual Meeting & Exposition
  • Place of Presentation: San Diego (USA)
  • Year and Date: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ISAAC法を用いた抗原特異的T細胞検出法の開発 (2016)
  • Author(s): 小澤龍彦，岸裕幸，浜名洋，田尻和人，呂福蓮，村口篤
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] ErbB2/ErbB3ヘテロ二量体におけるERKを介したErbB2 Thr-677リン酸化によるフィードバック制御 (2016)
  • Author(s): 河崎優希，崎村綾香，パクチョルミン，都丸里佳，小澤龍彦，周越，成田香織，村口篤，櫻井宏明
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 関節リウマチ患者由来モノクローナル抗CCP抗体の取得と抗原の解析 (2016)
  • Author(s): 岸裕幸，津田玲奈，小澤龍彦，村口篤
  • Organizer: 第28回日本神経免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 長崎ブリックホール（長崎県・長崎市）
  • Year and Date: 2016-09-29 – 2016-09-30
  • Invited
• [Presentation] Rapid generation of monoclonal antibodies using lymphocyte-microarray chip (2016)
  • Author(s): Ozawa T, Kishi H., and Muraguchi A
  • Organizer: 第68回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: ANAクラウンプラザホテル富山・富山国際会議場（富山県・富山市）
  • Year and Date: 2016-09-27 – 2016-09-29
  • Invited
• [Presentation] Cis-interaction of TCRs and antigen/MHC class I complexes on CD8+ T cells causes their activation (2016)
  • Author(s): Kishi H, Jin A, Hamana H, Shitaoka K, Tajiri K, Kobayashi E, Kusano S, Yokoyama S, Ozawa T, Nagai T, Obata T, Hatakeyama S, Horii M, Hu Y, Zhang F, Muraguchi A.
  • Organizer: 2016 International Congress of Immunology
  • Place of Presentation: Melbourne (Australia)
  • Year and Date: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A rapid and efficient single-cell manipulation method using microwell array chip (ISAAC) technology for screening antigen-specific cytokines-secreting T-cells. (2016)
  • Author(s): Ozawa T, Kishi H, Hamana H, Tajiri K, Lyu F, Muraguchi A.
  • Organizer: 2016 International Congress of Immunology
  • Place of Presentation: Melbourne (Australia)
  • Year and Date: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A rapid and easy system for screening of antigen-specific TCRs. (2016)
  • Author(s): Hamana H, Kishi H, Shitaoka K, Piao X, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 2016 International Congress of Immunology
  • Place of Presentation: Melbourne (Australia)
  • Year and Date: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of tumor-specific T cell receptors of primary tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) from B16F10 melanoma-bearing mice at single cell levels. (2016)
  • Author(s): Shitaoka K, Hamana H, Kishi H, Ozawa T, Muraguchi A
  • Organizer: 2016 International Congress of Immunology
  • Place of Presentation: Melbourne (Australia)
  • Year and Date: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Establishment of West Nile virus-neutralizing human monoclonal antibodies derived from the individuals vaccinated with inactivated Japanese encephalitis virus by ISAAC technology. (2016)
  • Author(s): Masaki H., Ozawa T., Takasaki T., Aoyama I., Yumisashi T., Konishi E., Kishi H., and Muraguchi A.
  • Organizer: 2016 International Congress of Immunology
  • Place of Presentation: Melbourne (Australia)
  • Year and Date: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] B16F10メラノーマ浸潤リンパ球の単一細胞解析による，がん特異的T細胞の同定およびTCR遺伝子治療の試み (2016)
  • Author(s): 下岡清美，浜名洋，呂福蓮，小澤龍彦，早川芳弘，岸裕幸，村口篤
  • Organizer: 第20回日本がん免疫学会総会
  • Place of Presentation: 大阪国際交流センター（大阪府・大阪市）
  • Year and Date: 2016-07-27 – 2016-07-29