関節リウマチ滑膜の上皮間葉移行の分子機構の解析と新規治療法への応用

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09536
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 田中 真生 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (10332719)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 靖彦 金沢大学, 医学系, 教授 (20313637) ; 杉本 直俊 金沢大学, 医学系, 准教授 (80272954)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: DIP2A / SNAIL1 / EMT

Outline of Annual Research Achievements

[1] DIP2AとSNAIL1の結合解析: 前年度と同じN末端GSTタグ付きDIP2A(1-99)のGST-DIP2A(Novus Biologicals)と、C末端Mycタグ付きSNAIL1-Myc(Origene)を用い、グルタチオンセファロースビーズでプルダウンアッセイを行った。GST-DIP2AのコントロールとしてリコンビナントGST(Sigma)を用いた実験で、SNAIL1-MycがGST-DIP2Aを介さず非特異的にグルタチオンセファロースビーズに結合することが判明した。対策としてビーズを非特異的結合の少ないシリカ製(Bioclone)に変更し、至適濃度のTweenおよび至適回数の洗浄によって、GST-DIP2AとSNAIL1-Mycの特異的結合が再現性をもって確認できた。
[2] BIACOREを用いたDIP2AとSNAIL1の結合解析: 結合のKd値を算出する精密な解析を予定していたが、機器(BIACORE 2000)の故障により中断した。復旧の見込みがないため、他大学での実施を検討している。
[3] マイクロアレイ解析に十分な数のヒト滑膜細胞サンプルは、現実的に一施設で短期間には得にくいため、米国NCBIのGEOに登録された関節リウマチ、変形性関節症および健常人関節滑膜細胞のマイクロアレイデータを用いて加重型遺伝子共発現網解析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA)に着手している。DIP2AとSNAIL1、さらにはⅠ型コラーゲン，α-平滑筋アクチン，telopeptide lysylhydroxylase(TLH)などEMTマーカーと、遺伝子の発現近接性(adjacency)を解析する。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

[1] 器材の問題: DIP2AとSNAIL1の精密な結合解析(Kd値の計算)に不可欠のBIACORE 2000が故障し、復旧の目途がたっていない。本実験にはオートサンプラーを装着した型が望ましく、他大学での実験を検討している。
[2] 人的資源の不足: 異動後の28年度は大学院生の配属がなく、予定の実験が遂行できなかった。

Strategy for Future Research Activity

滑膜細胞遺伝子発現のパブリックデータを用いたWGCNAの解析結果に基づき、今後の実験の効率化をはかる。すなわちDIP2AやSNAIL1の遺伝子発現と近接性のあるもの、EMTマーカー遺伝子群と近接性のあるものを同定し、in vitroでのEMT実験の評価対象とする。FRET実験は2分子FRETで蛍光寿命の計測が可能な特別な機材を必要とし、さらに解析に熟練が必要であるため、十分検討して着手する。

Causes of Carryover

器材の故障、人的資源の不足から当該年度の実験が手つかずで、次年度に実施することになった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

他施設でBIACORE実験を行う。WGCNAの結果を多いに参考として、EMTに関する培養細胞実験系を効率よく組み立てる。2分子FRETや共焦点顕微鏡にてDIP2AとSNAIL1の細胞内相互作用の観察実験を行う。