2015 Fiscal Year Research-status Report
ウイルスベクターを使用しない安全な血友病遺伝子・細胞治療法の確立
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15K09662
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
松井 英人 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (00571027)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉本 充彦 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (80192128)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 血友病 / 遺伝子治療 / 細胞治療 / ベクター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
自己細胞を用いた血友病A細胞治療をさらに安全に臨床応用するには、ウイルスベクターを使用せずに患者自身の細胞へFⅧを効率よく遺伝子導入し、持続して発現させることができるベヒクル細胞を大量に作製する方法を確立する必要がある。そこで構築したpiggyBacトランスポゾン由来のFⅧ発現ベクターを血友病患者由来のヒトiPS細胞へ導入し、FⅧ遺伝子発現を検討する必要がある。また、FⅧを導入したiPS細胞を様々な細胞へ分化誘導することで、FⅧがどの細胞で効率よく発現し分泌することが明らかになれば、細胞治療に必要なベヒクル細胞を患者iPS細胞から無限大に大量に作製することが可能となる。
GFP発現プラスミドのサイズが4.1Kbであるのに対してヒト第Ⅷ因子(FⅧ:全長型、Bドメイン欠如型、ブタとヒトのハイブリッド型)発現プラスミドは、それぞれ10.6 kb、8.1 kb、8.0 kbとサイズが大きく、プラスミド導入の効率が低下することが予想される。これまでの検討では同時に遺伝子導入を行うpiggyBac転移酵素(transposase)発現プラスミドとの比率1:4が最も効率よく遺伝子導入が可能であった。前年度は、新規遺伝子導入法(Neon, Nucleofector, NEPA21等の電気穿孔法)や、ベクターの複数回投与等行い遺伝子導入効率の向上を検討した。その結果サイズが大きくなればなるほど遺伝子導入効率は低下するが、複数回投与することで、十分なFVIII遺伝子発現に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
各種細胞に新規piggyBacトランスポゾン由来のFⅧ発現ベクターを用いて遺伝子導入を行い、十分なFVIII活性の分泌を確認している。
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| Strategy for Future Research Activity |
一般にES細胞やiPS細胞等の未分化多能性幹細胞は、レンチウイルスベクター等による遺伝子導入効率が悪く、また導入した外来遺伝子の発現が維持できないサイレンシング現象がみられる。我々のiPS細胞におけるGFP遺伝子を導入した検討において、新規piggyBac ベクターはレンチウイルスベクターよりも遺伝子導入効率がよく、また導入された遺伝子のサイレンシングもかなり回避出来ることを見出している。今年度は分泌されるFⅧ活性の長期持続性を確認したい。また血友病患者より樹立したiPS細胞へもFⅧ発現piggyBacベクターを導入し、FⅧの発現分泌を測定する。
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| Causes of Carryover |
物品購入費の中に海外からの輸入品が含まれており、為替レートの変動により若干安く納入することができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度に繰り越して使用する予定である。
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[Presentation] Novel gene therapy strategy for hemophilia A by hydrodynamic gene delivery combined with non-viral piggyBac transposon vector in canine model2015
Author(s)
Noda M, Matsui H, Matsunari Y, Ochi S, Shima M, Fukuoka Y, Sato T, Anai H, Kichikawa K, Nakayama M, Hotta A, Sugimoto M
Organizer
2015 Annual Meeting of the American Society of Hematology
Place of Presentation
オーランド、アメリカ合衆国
Year and Date
2015-12-07
Int'l Joint Research
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