胆管癌におけるエピジェネティクスを標的とした新規分子標的治療薬の検討

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10191
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 近本 亮 熊本大学, 医学部附属病院, 准教授 (10419640)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 美馬 浩介 熊本大学, 医学部附属病院, 病院教員 (00546559) ; 中川 茂樹 熊本大学, 医学部附属病院, 寄附講座教員 (10594872) ; 岡部 弘尚 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (40573621) ; 林 洋光 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (80625773)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: EZH2 / DZNep / 胆管癌 / 細胞周期 / アポトーシス / Angiogenesis / VASH1

Outline of Annual Research Achievements

【背景】 EZH2はポリコーム蛋白群の一つであり、ヒストン3リジン27 (H3K27)をトリメチル化することで遺伝子発現を抑制し、癌の進展に関与する事が知られている。特に胆管癌においてはEZH2が細胞周期及び血管新生を制御し、癌細胞の増殖を促進する事が報告されている。今回、EZH2が血管新生を制御し癌細胞の増殖を促進するメカニズムを明らかにすること及び、EZH2阻害剤である3-deazaneplanocin A (DZNep)を用いた薬物的EZH2阻害の効果と、胆管癌治療のキードラッグであるgemcitabineとの併用効果を検証することを目的とした。
【方法】 胆管癌におけるマイクロアレイデータベースを用いて、Bioinformatics解析を行う事で、EZH2と血管新生の関係を検討した。胆管癌細胞株であるRBE及びTFK-1を用いて、DZNep単独投与及びgemcitabineとDZNep併用における現象の変化及び標的遺伝子の変化を検討した。
【結果】 GSEA (gene set enrichment analysis)を用いて解析すると、EZH2の高発現と血管新生の遺伝子セットの高発現は有意に相関を認めた。また、in vitroにおいてEZH2の発現を抑制すると有意に血管新生抑制因子であるVASH1 (Vasohibin-1)の発現上昇を認めた。胆管癌細胞株において、DZNep単独投与ではDMSO投与群と比して、gemcitabine/DZNep併用ではgemcitabine単独と比して、EZH2の発現低下及び、H3K27の脱メチル化、増殖能の低下、G1-arrestを認めた。また、アポトーシス細胞の増加およびp16INK4a、p17KIP1の発現上昇を認めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は新たにEZH2と血管新生の関係をBioinformaticsの手法を用いて明らかにした。EZH2は血管新生の遺伝子セットと有意に正の相関を示し、in vitroの実験においてもEZH2阻害により血管新生が抑制される事が示唆された。
更に本年度までの実験では、間接的なEZH2阻害剤であるDZNepを用いて薬剤的なEZH2阻害が胆管癌細胞株に与える影響を明らかにした。
次年度は腫瘍のスライスを培養するex-vivo培養系をセットアップし、腫瘍微小環境を含めた癌組織に薬剤が与える影響を検討する。
また、EPZ-6438をはじめとする新規EZH2阻害剤を用いた実験を予定している。
これらから、実験は概ね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

これまでのDZNepを用いた実験で得られた結果をもとに、選択的EZH2阻害剤であるEPZ-6438を用いた実験を進める。
1.胆管癌細胞株におけるEZH2阻害剤EPZ-6438の効果の評価及び下流の遺伝子変化の確認
EZH2阻害剤の胆管癌における報告は少なく、その効果は未だ明らかでない。胆管癌細胞株を用いてEPZ-6438が癌増殖・浸潤・遊走・血管新生に与える効果及び標的遺伝子の発現変化を評価する事で臨床応用へ向けた第一歩とする。
2.ヒト胆管癌切除検体から得られるTissue sliceを用いた検討（ex vivo）
EPZ-6438のヒト胆管癌組織における抗腫瘍効果及び標的遺伝子に与える影響の評価：当科においては、細胞株やマウスを用いたin vitro, in vivoの実験のみならず、手術により得られるヒト胆管癌組織が継続的に入手可能である。この手術検体のスライス（Precision cut slice）を用いて薬剤と共にカルチャーする事で、腫瘍微小環境を保持したまま、ヒト検体における薬剤の効果を評価することが可能である。このex vivoの実験系を用いてEPZ-6438を添加した際の抗腫瘍効果、標的遺伝子の発現変化、血管新生に与える影響などを評価する。これによりヒト胆管癌における有用性を評価することができ、臨床応用への足がかりとすることが出来る。
抗癌剤及びEZH2阻害剤の効果予測マーカーとしてのEZH2の有用性の検討：同様に腫ex vivoにおいて腫瘍のEZH2発現と抗癌剤（ゲムシタビン）、EPZ-6438の効果を比較することで抗腫瘍薬の効果予測マーカーとしてのEZH2の有用性を検討する。

Causes of Carryover

医局内保管の試薬、消耗品を使用することが出来たため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

主に各試薬及び消耗品購入費に充てる予定である。また、情報収集、研究成果発表にかかる旅費、及び研究データ管理、資料整理のための事務補佐員の雇用経費にも充てたいと考える。

Research Products

• [Journal Article] Prognostic impacts of postoperative complications in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma after curative operations. (2017)
  • Author(s): Miyata T, Yamashita YI, Yamao T, Umezaki N, Tsukamoto M, Kitano Y, Yamamura K, Arima K, Kaida T, Nakagawa S, Imai K, Hashimoto D, Chikamoto A, Ishiko T, Baba H.
  • Journal Title: Int J Clin Oncol. Volume: Feb 15 Pages: Epub
  • DOI: 10.1007/s10147-017-1099-9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Preoperative High Maximum Standardized Uptake Value in Association with Glucose Transporter 1 Predicts Poor Prognosis in Pancreatic Cancer. (2017)
  • Author(s): Chikamoto A, Inoue R, Komohara Y, Sakamaki K, Hashimoto D, Shiraishi S, Takamori H, Yamashita YI, Yoshida N, Yamanaka T, Yamashita Y, Baba H.
  • Journal Title: Ann Surg Oncol. Volume: Feb 8 Pages: Epub
  • DOI: 10.1245/s10434-017-5799-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] C5a receptor (CD88) promotes motility and invasiveness of gastric cancer by activating RhoA. (2016)
  • Author(s): Kaida T, Nitta H, Kitano Y, Yamamura K, Arima K, Izumi D, Higashi T, Kurashige J, Imai K, Hayashi H, Iwatsuki M, Ishimoto T, Hashimoto D, Yamashita Y, Chikamoto A, Imanura T, Ishiko T, Beppu T, Baba H.
  • Journal Title: Oncotarget. Volume: 7(51) Pages: 84798-84809
  • DOI: 10.18632/oncotarget.12656.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Statin attenuates cell proliferative ability via TAZ (WWTR1) in hepatocellular carcinoma. (2016)
  • Author(s): Higashi T, Hayashi H, Kitano Y, Yamamura K, Kaida T, Arima K, Taki K, Nakagawa S, Okabe H, Nitta H, Imai K, Hashimoto D, Chikamoto A, Beppu T, Baba H.
  • Journal Title: Med Oncol. Volume: 33(11) Pages: 123
  • DOI: 10.1007/s12032-016-0845-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Heterogeneity of KRAS Mutations in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. (2016)
  • Author(s): Hashimoto D, Arima K, Yokoyama N, Chikamoto A, Taki K, Inoue R, Kaida T, Higashi T, Nitta H, Ohmuraya M, Hirota M, Beppu T, Baba H.
  • Journal Title: Pancreas. Volume: 45(8) Pages: 1111-4
  • DOI: 10.1097/MPA.0000000000000624.
  • Peer Reviewed