カクテルペプチドワクチン療法とS-1隔日投与を併用した低侵襲な新規膵癌治療の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10195
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 廣野 誠子 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60468288)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清水 敦史 和歌山県立医科大学, 医学部, 学内助教 (00637910) ; 山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20191190) ; 川井 学 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (40398459) ; 岡田 健一 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (50407988) ; 宮澤 基樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (90549734)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 膵癌 / ペプチドワクチン

Outline of Annual Research Achievements

膵癌の浸潤規定因子を同定する目的で、膵癌組織の凍結切片から同一サンプルの浸潤部と非浸潤癌（PanIN3）部をマイクロダイセクションにより、それぞれの細胞を回収し、そのRNAを抽出した後、浸潤癌部とPanIN3部のRNA発現をマイクロアレイにて比較した。その結果、全てのサンプルにおいて浸潤癌でPanIN3よりも高発現を認めた遺伝子群のうち最も両群で差が大きかったMUC16と、そのリガンドであるmesothelinに着目した。両遺伝子の発現パターンを、切除標本の免疫染色解析にて確認した結果、両遺伝子は、同じ癌細胞のinvasive frontに強発現を認めた。さらに、二重蛍光染色と共免疫沈降法により、MUC16とmesothelinは互いに結合し、膵癌細胞に発現していることが分かった。そこで、膵癌細胞株を用いて、siRNAにてMUC16あるいはmesothelinの発現量を低下させた細胞株では、浸潤能ならびに遊走能とも有意に低下した。すなわち、MUC16とmesothelinは、互いに結合し、膵癌の浸潤・転移に大きな役割を果たしていることが証明できた。そこで、手術により切除したパラフィン切片を用いて、両遺伝子の免疫染色解析を行い、臨床因子との関連を確認した結果、MUC16ならびにmesothelin強発現は、独立した予後不良因子であることが分かった。以上より、MUC16とmesothelinは、有効な膵癌の新規治療のtarget遺伝子であり、われわれは、これらの遺伝子由来ペプチドワクチン療法の開発に取り組んでいる。
現在、特定のHLAに結合するペプチドの構造モチーフ検索データベースBIMASを利用し、HLAに親和性の高いペプチドを選択し、健常人由来の末梢単核球(PBMC)を用いた細胞障害性Tリンパ球(cytotoxic T lymphocyte: CTL)の誘導を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在、われわれは、targetとするMUC16とmesothelinの候補ペプチドに対する、CTLの誘導を行っている。HLA結合予測アルゴリズムによる候補ペプチドとして、MUC16は22種類、mesothelinは19種類を選択した。これらの候補ペプチドに対して、健常人由来のPBMCを用いて、CTLの誘導を行う実験は、ペプチドワクチン作成の過程で最も労力・時間のかかる段階である。しかしながら、このステップにより、有効なペプチドを同定できれば、本年度の前半には、次の段階のCTLラインの樹立とCTLクローンの樹立まで行うことが可能となり、新規ペプチドワクチンの開発までスムーズにいくと考える。新規ペプチドワクチンを開発した後は、進行・再発膵癌患者を対象とした、第Ⅰ相臨床試験に進む予定である。

Strategy for Future Research Activity

HLA-A*2402陽性、あるいはHLA*02陽性の健常人末梢血から分離したPBMCを用いて、MUC16ならびにmesothelinの候補ペプチドのペプチドパルスを行い、CTLを誘導し、誘導したCTLのIFN-γ産生をELISPOT assayにて測定する。続いて、ここで同定したペプチドから誘導したCTLのライン化とCTLクローンの樹立を行う。次に、MUC16およびmesothelinを発現している膵癌細胞株PK9, Capan-2と、非発現細胞株MIAPaCa2, Panc1を用いて、MUC16およびmesothline発現細胞株と非発現細胞株の、HLA-A*2402あるいはHLA*02発現陽性細胞株と陰性細胞株の計4群に対して、上記で作成したCTLクローンを用いてkilling assayを行う。killingは24hr-Cr release assayにて評価する。MUC16およびmesothlineの発現(+)かつHLA-A*2402あるいはHLA*02の発現(+)の膵癌細胞株にのみ選択的に細胞傷害を示すCTLクローンが誘導されれば、そのペプチド配列をもってエピトープペプチドと同定する。
上記の実験で同定したペプチドを用いたペプチドワクチンを開発し、進行・再発膵癌患者を対象に、3 patients cohort法にて、第Ⅰ相臨床試験を行い、その安全性と推奨投与量の決定を行う。ペプチド投与量は、0.5mg, 1mg, 2mgとドーズエスカレーションする。ペプチドワクチンの推奨投与量は、ペプチド特異的免疫応答がプラトーになった用量とする。第Ⅰ相臨床試験が終了した時点で、カクテルワクチンの開発に取り組む予定である。